SINTESI DI GLICOPOLIMERI CON ATTIVITA' ANTI INFIAMMATORIA E TEST IN VITRO SU UN MODELLO DI GOTTA

Gout is a common type of inflammatory arthritis caused by the deposition of monosodium urate (MSU) crystals in the joints. These crystals derive from hyperuricemia, defined as levels of uric acid above the saturation concentration. The pathogenetic mechanisms of gout are not fully understood, but the activation of the NLRP3 inflammasome, the consequent production of IL-1β and neutrophils influx in the damaged site seem to play a key role in its development. To date, different treatments are available, but the achievement of serum urate targets is infrequent, consequently, new strategies to improve quality of gout care are needed. Studies have recently demonstrated that the Mannose Receptor (MR), a glycoprotein expressed by macrophages and other immune cells, is involved in certain inflammatory pathways. Hence, macrophage modulation through the MR could represent a therapeutic additional approach to control inflammation. In the following work, the synthesis of the glycopolymer (SO4-3-Gal)240 specifically targeted to MR and its testing in an in vitro gout model are reported. This polymer, in virtue of the selective sulfation, can bind the MR and trigger its endocytosis, blocking its re-exposition to the cell surface for a certain period. The hiding of the receptor could prevent its interaction with other effector cells and circulating molecules, leading to a possible anti-inflammatory activity. The synthesis was performed starting from D-galactose pentaacetate, which was conjugated to N-Hydroxyethyl acrylamide, to introduce the vinyl residue necessary for the subsequent polymerization reaction. After deacetylation, eventually, D-galactopyranosyloxyethyl acrylamide was sulfated in position 3 to obtain 3-O-sulfo-D-galactopyranosyloxyethyl acrylamide. D-galactopyranosyloxyethyl acrylamide and 3-O-sulfo-D-galactopyranosyloxyethyl acrylamide were obtained with a yield of ca. 25% and 60% respectively. Starting from these monomers, we generated by Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (RAFT) technique two polymers, (SO4-3-Gal)240, capable of binding MR, and Gal240, used as negative control. RAFT is a controlled living radical polymerization, which allows to obtain polymers with a defined molecular weight and a low polydispersity index (Ð). Polymers were efficiently obtained with a Ð<1.3 and a molar yield of ca. 70%. The ability of the sulfated glycopolymers to prevent or reduce inflammation was tested on an in vitro model of gout. THP-1 monocytic cells were differentiated into macrophages by incubation with phorbol 12-myristate 13-acetate and, after a variable rest period of 3 or 24 hours, cells were preincubated with glycopolymer solution at different concentration and subsequently stimulated with 0.1 mg/mL MSU crystals or 10 ng/mL LPS, as positive control, for 24 hours. The anti-inflammatory effect of the sulfated polymer was evaluated by ELISA assay to quantify intracellular and released IL-1β and CXCL1. Indeed, in acute gout we observe a prominent production of NRLP3-dependent chemokine CXCL1 and pro-inflammatory cytokine IL-1β, which blockade was found to be effective in reducing the gout attacks. The preliminary results obtained from the condition with a 3 h rest period and the highest polymers concentration used (600 µM sugar unit), showed a 34% decrease in IL-1β concentration in supernatants and 24,8% decrease in lysates. Conditions with 24 h rest period and 300 µM or 600 µM sugar unit concentrations did not appear to promote a reduction in IL-1β production. (SO4-3-Gal)240 reduced the release and production of CXCL1 by 24% and 50% respectively in the condition of 3 h rest period and 600 µM sugar unit concentration. The anti-inflammatory effect was not observed after incubation with Gal240 negative control polymer, thus suggesting a specific receptor-mediated mechanism. Further investigation will be required to elucidate the role of MR in gout.

La gotta è una forma comune di artrite infiammatoria con deposizione di cristalli di urato monosodico (MSU) nelle articolazioni, dovuti ad iperuricemia. Il meccanismo patogenetico non è ancora del tutto chiaro, ma, l’attivazione dell’inflammasoma NLRP3, la successiva produzione di IL-1β e il richiamo di neutrofili nel sito di danno si sono dimostrati avere un ruolo chiave nel suo sviluppo. Diversi sono i trattamenti ad oggi disponibili ma il raggiungimento degli obbiettivi terapeutici è poco frequente e di conseguenza sono necessarie nuove strategie per migliorare la qualità del trattamento della gotta. È stato dimostrato che il recettore del mannosio (MR), una glicoproteina espressa da macrofagi e altre cellule immunitarie, è implicato in alcuni processi infiammatori. La modulazione dei macrofagi attraverso MR potrebbe rappresentare un approccio terapeutico aggiuntivo per controllare l’infiammazione. Nel seguente elaborato si riportano la sintesi del glicopolimero (SO4-3-Gal)240 e la valutazione della sua attività in un modello in vitro di gotta. Questo polimero, grazie alla solfatazione selettiva può legare il MR e innescare la sua endocitosi, bloccando la riesposizione sulla superficie cellulare per un certo periodo, esercitando, in tal modo, una possibile attività antinfiammatoria. La sintesi è stata eseguita partendo dal D-galattosio pentaacetato, al quale è stato legato N-idrossietil acrilammide, per introdurre un residuo vinilico necessario per la successiva reazione di polimerizzazione. Dopo essere stato deacetilato, D-galattopiranosilossietil acrilammide è stato, eventualmente, solfatato in posizione 3 per ottenere 3-O-sulfo-D-galattopiranosilossietil acrilammide. D-galattopiranosilossietil acrilammide e 3-O-sulfo-D-galattopiranosilossietil acrilammide sono stati ottenuti con una resa di circa 25% e 60% rispettivamente. Da questi monomeri sono stati sintetizzati, mediante la tecnica di polimerizzazione Reversible Addition-Fragmentation chain Transfer (RAFT) due polimeri, (SO4-3-Gal)240, in grado di legare MR e Gal240, usato come controllo negativo. I polimeri sono stati efficientemente ottenuti con indice di polidispersione (Ð) <1,3 e una resa molare di circa 70%. La capacità dei glicopolimeri solfati di prevenire o ridurre l’infiammazione è stata testata su un modello in vitro di gotta. Le cellule monocitiche THP-1 sono state differenziate in macrofagi utilizzando forbolo 12-miristato 13-acetato e, dopo un periodo variabile di riposo di 3 o 24 ore, le cellule sono state preincubate con una soluzione dei glicopolimeri a diverse concentrazioni e successivamente stimolate con cristalli di MSU 0,1 mg/mL o LPS 10 ng/mL, come controllo positivo, per 24 ore. L’effetto antiinfiammatorio del polimero solfato è stato valutato mediante test ELISA per la quantificazione di IL-1β e CXCL1. Infatti, nella gotta acuta si osserva una marcata produzione di CXCL1, una chemochina dipendente da NLRP3, e di IL-1β, una citochina pro-infiammatoria. Il blocco di IL-1β e CXCL1 è risultato efficace nel ridurre gli attacchi di gotta. I risultati preliminari ottenuti dalla condizione con un periodo di riposo di 3 ore e la massima concentrazione di polimeri utilizzata (600 µM in unità di zucchero), mostrano una diminuzione del 34% dei livelli di IL-1β nei surnatanti e del 24,8% nei lisati. Le condizioni con il periodo di riposo di 24 ore ed i polimeri a concentrazione di unità di zucchero di 300 µM o 600 µM, non sembrano evidenziare una ridotta produzione di IL-1β. (SO4-3-Gal)240 è stato in grado di ridurre del 24% e del 50% rispettivamente il rilascio e la produzione di CXCL1, con il periodo di riposo di 3 ore e 600 µM di concentrazione in unità di zucchero. L’effetto antiinfiammatorio non è stato osservato dopo incubazione con il polimero Gal240, suggerendo un meccanismo mediato dal recettore. Ulteriori indagini saranno necessarie per chiarire il ruolo di MR nella gotta.