La steatoepatite non alcolica (NASH) è una patologia epatica cronica considerata la forma più grave e avanzata della steatosi epatica non alcolica (NAFLD). Tale patologia è caratterizzata da accumulo lipidico, infiammazione, danno epatocellulare e fibrosi, di vario grado a seconda dello stadio di progressione, e può evolvere in patologie più gravi come cirrosi ed epatocarcinoma. Data la crescente incidenza e il fatto che, ad oggi, non esista una terapia approvata per il trattamento della NASH, questa patologia rappresenta un grave problema di salute pubblica e sono in corso numerosi studi per valutare nuovi target farmacologici e potenziali terapie. In un precedente studio condotto nel nostro laboratorio è stato dimostrato che il tirosolo, un composto fenolico contenuto nell’olio extravergine di oliva, è in grado di migliorare la fibrosi epatica tramite la modulazione delle NADPH ossidasi, enzimi deputati alla produzione delle specie reattive dell’ossigeno (ROS), la cui upregolazione è stata osservata anche nella NASH. In questo lavoro di tesi sperimentale è stata valutata l’efficacia del tirosolo in un modello murino di NASH, ottenuto mediante somministrazione combinata di una dieta ad alto contenuto di grassi e fruttosio (high fructose high fat diet, HFHFD) per 14 settimane e tetracloruro di carbonio per via intraperitoneale per le ultime 4 settimane. Sono stati utilizzati tre gruppi di topi maschi C57BL/6: un gruppo di topi con NASH (n=6), un gruppo con NASH a cui è somministrato il tirosolo (n=6) e un gruppo di animali sani di controllo (n=3). Il tirosolo è stato somministrato tramite gavage orale a partire dalla quarta settimana di dieta HFHFD una volta al giorno, mentre agli altri è stato somministrato veicolo acquoso. Durante il trattamento sono stati effettuati dei test comportamentali per valutare la forza muscolare (Gripping e Grid test) e lo stato d’ansia (Open field e Forced Swim test). Sul tessuto epatico prelevato al momento del sacrificio, è stato valutato il grado di infiammazione, steatosi e fibrosi utilizzando colorazioni specifiche, quali ematossilina ed eosina (H&E), Oil Red O e colorazione tricromica. Dal momento che nella NASH vi è una forte componente infiammatoria, è stata fatta un’analisi citofluorimetrica per valutare le diverse popolazioni di cellule immunitarie (linfociti CD4+/CD8+, macrofagi M1/M2, NK), sia circolanti che reclutate a livello epatico. È stata, inoltre, effettuata un’analisi immunoistochimica per valutare l’espressione delle proteine α-SMA e NOX1. Dai test comportamentali è emerso che i topi trattati con tirosolo hanno una tendenza di miglioramento delle prestazioni fisiche e una tendenza di riduzione dell’ansia rispetto agli animali con NASH, che risulta paragonabile a quello degli animali sani. La valutazione istologica del tessuto epatico ha evidenziato che il modello murino NASH messo a punto in questo progetto è caratterizzato da steatosi, infiammazione e fibrosi. Il trattamento con tirosolo ha permesso un miglioramento della NASH, come dimostrato dal grado inferiore sia di steatosi che di fibrosi osservati nel tessuto epatico degli animali trattati con tirosolo rispetto a quello degli animali trattati con solo veicolo. Il miglioramento osservato con l’analisi istologica negli animali trattati con tirosolo è stato accompagnato da una riduzione, sia nel fegato che nel sangue, di macrofagi M1, cellule NK, linfociti T helper e a un aumento dei linfociti Treg. Infine, le analisi immunoistochimiche hanno evidenziato una riduzione dell’espressione di α-SMA e NOX1 nei topi trattati con tirosolo rispetto a quelli con NASH, confermando la riduzione della fibrosi e suggerendo una riduzione dello stress ossidativo. In conclusione, il tirosolo potrebbe rappresentare un promettente candidato per il trattamento della NASH, essendo in grado di ridurre l’infiammazione, la fibrosi e lo stress ossidativo nel fegato.

Valutazione dell'efficacia del tirosolo in un modello sperimentale di steatoepatite non alcolica

CAMPAGNARO, SARA
2021/2022

Abstract

La steatoepatite non alcolica (NASH) è una patologia epatica cronica considerata la forma più grave e avanzata della steatosi epatica non alcolica (NAFLD). Tale patologia è caratterizzata da accumulo lipidico, infiammazione, danno epatocellulare e fibrosi, di vario grado a seconda dello stadio di progressione, e può evolvere in patologie più gravi come cirrosi ed epatocarcinoma. Data la crescente incidenza e il fatto che, ad oggi, non esista una terapia approvata per il trattamento della NASH, questa patologia rappresenta un grave problema di salute pubblica e sono in corso numerosi studi per valutare nuovi target farmacologici e potenziali terapie. In un precedente studio condotto nel nostro laboratorio è stato dimostrato che il tirosolo, un composto fenolico contenuto nell’olio extravergine di oliva, è in grado di migliorare la fibrosi epatica tramite la modulazione delle NADPH ossidasi, enzimi deputati alla produzione delle specie reattive dell’ossigeno (ROS), la cui upregolazione è stata osservata anche nella NASH. In questo lavoro di tesi sperimentale è stata valutata l’efficacia del tirosolo in un modello murino di NASH, ottenuto mediante somministrazione combinata di una dieta ad alto contenuto di grassi e fruttosio (high fructose high fat diet, HFHFD) per 14 settimane e tetracloruro di carbonio per via intraperitoneale per le ultime 4 settimane. Sono stati utilizzati tre gruppi di topi maschi C57BL/6: un gruppo di topi con NASH (n=6), un gruppo con NASH a cui è somministrato il tirosolo (n=6) e un gruppo di animali sani di controllo (n=3). Il tirosolo è stato somministrato tramite gavage orale a partire dalla quarta settimana di dieta HFHFD una volta al giorno, mentre agli altri è stato somministrato veicolo acquoso. Durante il trattamento sono stati effettuati dei test comportamentali per valutare la forza muscolare (Gripping e Grid test) e lo stato d’ansia (Open field e Forced Swim test). Sul tessuto epatico prelevato al momento del sacrificio, è stato valutato il grado di infiammazione, steatosi e fibrosi utilizzando colorazioni specifiche, quali ematossilina ed eosina (H&E), Oil Red O e colorazione tricromica. Dal momento che nella NASH vi è una forte componente infiammatoria, è stata fatta un’analisi citofluorimetrica per valutare le diverse popolazioni di cellule immunitarie (linfociti CD4+/CD8+, macrofagi M1/M2, NK), sia circolanti che reclutate a livello epatico. È stata, inoltre, effettuata un’analisi immunoistochimica per valutare l’espressione delle proteine α-SMA e NOX1. Dai test comportamentali è emerso che i topi trattati con tirosolo hanno una tendenza di miglioramento delle prestazioni fisiche e una tendenza di riduzione dell’ansia rispetto agli animali con NASH, che risulta paragonabile a quello degli animali sani. La valutazione istologica del tessuto epatico ha evidenziato che il modello murino NASH messo a punto in questo progetto è caratterizzato da steatosi, infiammazione e fibrosi. Il trattamento con tirosolo ha permesso un miglioramento della NASH, come dimostrato dal grado inferiore sia di steatosi che di fibrosi osservati nel tessuto epatico degli animali trattati con tirosolo rispetto a quello degli animali trattati con solo veicolo. Il miglioramento osservato con l’analisi istologica negli animali trattati con tirosolo è stato accompagnato da una riduzione, sia nel fegato che nel sangue, di macrofagi M1, cellule NK, linfociti T helper e a un aumento dei linfociti Treg. Infine, le analisi immunoistochimiche hanno evidenziato una riduzione dell’espressione di α-SMA e NOX1 nei topi trattati con tirosolo rispetto a quelli con NASH, confermando la riduzione della fibrosi e suggerendo una riduzione dello stress ossidativo. In conclusione, il tirosolo potrebbe rappresentare un promettente candidato per il trattamento della NASH, essendo in grado di ridurre l’infiammazione, la fibrosi e lo stress ossidativo nel fegato.
2021
Evaluation of the efficacy of tyrosol in an experimental model of non-alcoholic steatohepatitis
NASH
Tirosolo
steatosi epatica
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