Stress Ossidativo e Trombosi:Studio della suscettibilità del dominio A2 ricombinante del fattore di von Willebrand alla proteolisi catalizzata da ADAMTS13 e proteasi leucocitarie

Ad oggi, è stato dimostrato come molte patologie differenti siano associate ad un particolare aumento del rischio trombotico ed insorgenza di malattie cardiovascolari. Questo fenomeno sembra essere dovuto allo stato pro-infiammatorio indotto da queste condizioni patologiche. Difatti, eventi pro-infiammatori sono caratterizzati da un'alterata regolazione dei sistemi associati all'endotelio e dalla produzione di specie reattive di ossigeno (ROS) e azoto (RNS), cosi come dall’ aumento plasmatico di alcuni fattori endogeni. Tra questi vi è il fattore di von Willebrand (vWF). Il vWF è una glicoproteina omo-multimerica composta da monomeri di 250 kDa, secreta a livello plasmatico sotto forma di UL-vWF. La secrezione del vWF avviene attraverso complessi pathways, che comprendono varie modifiche post-traduzionali, formazione di ponti disolfuro e cleavage proteolitici. La proteina viene inizialmente sintetizzata a livello dei megacariociti e delle cellule endoteliali come precursore pre-pro-vWF (2813 amminoacidi), per essere poi secreta direttamente dal trans-Golgi, oppure immagazzinata all’interno dei corpi di Weibel-Palade nelle cellule endoteliali o dentro gli ⍺-granuli delle piastrine. Il potenziale pro-trombotico del vWF aumenta all’aumentare del peso molecolare dei multimeri, e quindi dello stato di oligomerizzazione. Questo è finemente regolato dall’ADAMTS13, metalloproteasi in grado di proteolizzare i multimeri di vWF con elevata specificità a livello del legame peptidico Tyr1605-Met1606 presente all’interno del dominio A2 della proteina. Studi precedenti condotti nel nostro Laboratorio hanno chiarito come l’ossidazione della Met1606 del vWF che si verifica in concomitanza di elevati livelli di stress ossidativo, ostacoli il taglio dei multimeri ad opera di ADAMTS13, portando ad un accumulo di polimeri UL-vWF dotati di maggiore potere pro-trombotico. Questo fenomeno risulta esemplificativo dell’interconnessione tra infiammazione e coagulazione: l’attivazione di uno stato infiammatorio a livello vasale porta ad una stimolazione dei monociti, inducendoli ad esprimere ed esporre il Tissue Factor, e concorre alla liberazione di composti reattivi fortemente ossidati, quali ROS e RNS. Lo stress ossidativo così indotto influisce sulla biochimica degli AA che compongono le proteine: nel caso della Met1606 del dominio A2 del VWF, avviene un’ossidazione del tioetere a solfossido. Questa ossidazione, che comporta un cambiamento di polarità dell’AA, rende il vWF non più accessibile all’ADAMTS13, portando ad una diminuita azione proteolitica sui multimeri. Recenti analisi hanno portato alla luce, inoltre, come la regolazione dello stato multimerico di vWF durante processi infiammatori non sia solo associata all’ADAMTS13, ma anche ad altre serin proteasi di tipo leucocitario quali elastasi, catepsina G e proteinasi 3. Queste ultime sono in grado di catalizzare un taglio proteolitico a livello del dominio A2 in siti differenti rispetto a quello di ADAMTS13. In questo modo, anche le serin proteasi possono concorrere all’equilibrio emostatico, soprattutto durante processi infiammatori. Allo scopo di studiare più in dettaglio la suscettibilità della Met1606 all’azione catalitica di ADAMTS13 (in condizioni di stress ossidativo e non) e delle proteasi leucocitarie si è proceduto con l’espressione e la purificazione del solo dominio A2 di vWF, utilizzando cellule di E.coli ingegnerizzate per la produzione della proteina. Dopo la caratterizzazione biochimico-strutturale della proteina, si sono svolte le analisi di suscettibilità alla proteolisi del dominio A2 purificato con i vari enzimi capaci di operarare un taglio proteolitico all’interno di tale dominio. I risultati ottenuti in questo elaborato di Tesi saranno utili a chiarire le basi strutturali e molecolari che determinato la specificità di taglio di una proteasi rispetto alle altre.