Gene therapy was created to treat single-gene disorders with recessive inheritance, by inserting a normal copy of the mutated gene into the appropriate tissues. In this thesis project, this innovative approach has been exploited with the aim of targeting a new protein involved in Muscular Dystrophies called Nfix. The Nfix gene, which codes for the transcription factor Nfix, is related to the activation and repression of gene transcription and, if silenced, can reduce the development of Dystrophies. Three different formulations of Stealth Cationic Liposomes, named “ALLH”, “2B” and “3A-2k”, have been formulated using Microfluidic system to deliver, inside the cells, a plasmid DNA capable of inducing silencing, via shRNA, of the Nfix gene. All formulations contained the cationic phospholipid DOTAP but differed in the other molecules containing: "ALLH" had high percentages of HSPC, a neutral phospholipid; “2B” was created with the neutral phospholipid DOPE to enhance plasmid release; “3A-2k” has seen the replacement of DOPE with Octadecylamine, with the same functionality, and post-insertion with the PiPB peptide to increase the targeting towards muscle cells. All the formulations have been tested in vitro, demonstrating a low encapsulation of the plasmid and an excessive stability which does not allow the efficient release of the loaded plasmid.

La terapia genica nasce per trattare malattie monogeniche a ereditarietà recessiva, inserendo una copia normale del gene mutato nei tessuti appropriati. In questo progetto di tesi, tale approccio innovativo è stato sfruttato con l’obiettivo di trattare un nuovo bersaglio coinvolto nelle Distrofie Muscolari chiamato Nfix. Il gene Nfix, che codifica per il fattore di trascrizione Nfix, è correlato all'attivazione e alla repressione della trascrizione di geni e se silenziato può ridurre lo sviluppo delle Distrofie. Tre differenti formulazioni di Liposomi Cationici Stealth, denominate “ALLH”, “2B” e “3A-2k”, sono state formulate mediante l’utilizzo di metodi fluidici per veicolare all’interno delle cellule DNA plasmidico capace di indurre il silenziamento, tramite shRNA, del gene Nfix. Tutte le formulazioni contenevano il fosfolipide cationico DOTAP ma differenziavano per le altre molecole contenenti: “ALLH” possedeva alte percentuali di HSPC, un fosfolipide neutro; “2B” è stata arricchita del fosfolipide neutro DOPE per aumentare il rilascio di plasmide; “3A-2k” ha visto la sostituzione del DOPE con l’octadecilammina, con la stessa funzionalità, e la coniugazione con il peptide PiPB per aumentare il direzionamento verso le cellule muscolari. Tutte le formulazioni sono state testate in vitro, dimostrando un basso incapsulamento del plasmide e una eccessiva stabilità che non permette il rilascio in modo efficiente del plasmide trasportato.

Stealth cationic liposomes as a delivery system for gene therapy

SCAPIN, NICOLA
2021/2022

Abstract

Gene therapy was created to treat single-gene disorders with recessive inheritance, by inserting a normal copy of the mutated gene into the appropriate tissues. In this thesis project, this innovative approach has been exploited with the aim of targeting a new protein involved in Muscular Dystrophies called Nfix. The Nfix gene, which codes for the transcription factor Nfix, is related to the activation and repression of gene transcription and, if silenced, can reduce the development of Dystrophies. Three different formulations of Stealth Cationic Liposomes, named “ALLH”, “2B” and “3A-2k”, have been formulated using Microfluidic system to deliver, inside the cells, a plasmid DNA capable of inducing silencing, via shRNA, of the Nfix gene. All formulations contained the cationic phospholipid DOTAP but differed in the other molecules containing: "ALLH" had high percentages of HSPC, a neutral phospholipid; “2B” was created with the neutral phospholipid DOPE to enhance plasmid release; “3A-2k” has seen the replacement of DOPE with Octadecylamine, with the same functionality, and post-insertion with the PiPB peptide to increase the targeting towards muscle cells. All the formulations have been tested in vitro, demonstrating a low encapsulation of the plasmid and an excessive stability which does not allow the efficient release of the loaded plasmid.
2021
Stealth cationic liposomes as a delivery system for gene therapy
La terapia genica nasce per trattare malattie monogeniche a ereditarietà recessiva, inserendo una copia normale del gene mutato nei tessuti appropriati. In questo progetto di tesi, tale approccio innovativo è stato sfruttato con l’obiettivo di trattare un nuovo bersaglio coinvolto nelle Distrofie Muscolari chiamato Nfix. Il gene Nfix, che codifica per il fattore di trascrizione Nfix, è correlato all'attivazione e alla repressione della trascrizione di geni e se silenziato può ridurre lo sviluppo delle Distrofie. Tre differenti formulazioni di Liposomi Cationici Stealth, denominate “ALLH”, “2B” e “3A-2k”, sono state formulate mediante l’utilizzo di metodi fluidici per veicolare all’interno delle cellule DNA plasmidico capace di indurre il silenziamento, tramite shRNA, del gene Nfix. Tutte le formulazioni contenevano il fosfolipide cationico DOTAP ma differenziavano per le altre molecole contenenti: “ALLH” possedeva alte percentuali di HSPC, un fosfolipide neutro; “2B” è stata arricchita del fosfolipide neutro DOPE per aumentare il rilascio di plasmide; “3A-2k” ha visto la sostituzione del DOPE con l’octadecilammina, con la stessa funzionalità, e la coniugazione con il peptide PiPB per aumentare il direzionamento verso le cellule muscolari. Tutte le formulazioni sono state testate in vitro, dimostrando un basso incapsulamento del plasmide e una eccessiva stabilità che non permette il rilascio in modo efficiente del plasmide trasportato.
Cationic liposomes
Delivery system
Gene therapy
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.12608/42424