Studi di traffico cellulare di nanoparticelle ANANAS fusogeniche e del loro cargo biotiniliato per il delivery di acidi nucleici

Le ANANAS (Avidin-Nucleic Acid NanoAssemblies) sono dei sistemi di poliavidina basati sull’interazione con gli acidi nucleici e sull’elevata affinità per la biotina che possono essere funzionalizzati con qualsiasi elemento preventivamente biotinilato. A contatto con le cellule, le ANANAS vengono internalizzate per endocitosi recettore mediata e raggiungono il comparto endo/lisosomiale. Ciò consente l’impiego per il trasporto di molecole idrofobiche e insensibili all’ambiente lisosomiale, ma ne impedisce l’utilizzo per molecole idrofiliche attive a livello citoplasmatico che possono subire fenomeni di degradazione in ambiente vescicolare, come ad esempio acidi nucleici (miRNA e siRNA). Per questo tipo di agenti terapeutici è necessario introdurre un sistema di veicolazione che ne permetta la protezione in ambiente endo/lisosomiale e il successivo l’escaping nel citoplasma. In questo progetto si vogliono generare formulazioni di ANANAS in grado di portare al di fuori dell’ambiente vescicolare cargo di natura idrofilica e/o macromolecolare non in grado di attraversare liberamente le membrane, quali ad esempio miRNA o siRNA. A questo scopo vengono studiati una serie di potenziali elementi fusogenici (Fus) pH sensibili in grado di assumere conformazioni destabilizzanti le membrane non appena il pH locale si riduce. Le ANANAS sono state direzionate verso cellule tumorali EGFR+ (HeLa e MDA-MB-231) e HER2+ (MCF-7) con anticorpi monoclonali (Cetuximab o Trastuzumab). Gli assemblati direzionati sono stati poi funzionalizzati con due potenziali elementi fusogenici (Fus2 e Fus3) ed il loro destino cellulare è stato studiato mediante microscopia confocale fluorescente. A questo scopo, le formulazioni sono state rese fluorescenti tramite l’aggiunta di fluorofori (Atto633 o Alexa633), biotinilati tramite linker irreversibile (Biotin-C6-Atto633) o riducibile (Biotin-dPEG4-SS-Atto633) nell’ambiente intracellulare, mentre il comparto vescicolare è stato evidenziato grazie ad una seconda sonda fluorescente, la calceina, presente nel mezzo di coltura. Mentre Fus3 non ha mostrato l’attività attesa, Fus2 si è dimostrato efficace, in quanto le nanoparticelle funzionalizzate con esso sono risultate in grado di destabilizzare le membrane del 25% delle vescicole cellulari. La destabilizzazione del comparto vescicolare promossa da ANANAS-Cetuximab-Fus2 comporta la fuoriuscita di piccole molecole, ma non delle nanoparticelle. L’impiego della chimica riducente (Biotin-dPEG4-SS-Atto633) per legare il cargo delle particelle si è rivelata promettente. Infatti, gli studi intracellulari con ANANAS-Cetuximab-Fus2-Biotin-dPEG4-SS-Atto633 hanno rivelato che è possibile rilasciare il cargo una volta che l’elemento fusogenico ha destabilizzato le vescicole. In sintesi, l’uso combinato sulla superficie delle nanoparticelle ANANAS di un direzionante, l’elemento Fus2 e la chimica del disolfuro per il caricamento reversibile dell’elemento attivo appare una strategia promettente per la veicolazione di acidi nucleici al citoplasma di cellule bersaglio.