Determinazione della presenza di strutture secondarie non canoniche del DNA di tipo i-Motif in cellule umane infettate dal virus HSV-1

Da anni è nota la presenza di strutture secondarie non canoniche degli acidi nucleici, tra cui le più studiate sono i G-quadruplex (G4) e gli i-Motif (iM), strutture a quattro filamenti polinucleotidici generati in regioni rispettivamente ricche in guanine (G) e citosine (C). Sequenze in grado di formare queste strutture sono generalmente localizzate nello stesso segmento genomico, ma su filamenti opposti. Le prime ad essere state studiate e ad aver stimolato l’interesse a livello di ricerca sono i G4, inizialmente analizzati in vitro e trovati a livello di telomeri umani ma anche di altri organismi. Successivamente, la loro identificazione in promotori di diversi oncogeni ha incrementato l’interesse nell’identificare l’effettivo ripiegamento di queste strutture a livello cellulare, al fine di studiarne il ruolo nella regolazione genica e caratterizzarli come bersagli di farmaci antineoplastici. Da qui, la ricerca si è estesa notevolmente, identificando strutture non canoniche di DNA e RNA anche a livello di microorganismi, come i virus. Il gruppo di ricerca della professoressa Richter da anni studia la presenza e il ruolo dei G4 negli herpesvirus, con particolare focus sugli Alphaherpesvirus umani (HSV-1, HSV-2, VZV). È stato dimostrato che il genoma di questi virus, già noto per essere ricco in GC, presenta moltissime sequenze in grado di ripiegarsi in G4, localizzate soprattutto nelle regioni ripetute del genoma e nei promotori dei geni Immediately Early (IE), dove la presenza di G4 è strettamente correlata all’espressione genica. Evidenze sperimentali hanno mostrato che la presenza dei G4 è cruciale per la propagazione del virus e che, quindi, queste strutture possono essere considerate dei validi bersagli terapeutici per la progettazione di nuovi farmaci antierpetici. Lo sviluppo di anticorpi specifici in grado di legare le strutture quadruplex, BG4 e iMab, ha permesso l’ottimizzazione di nuove tecniche in grado di visualizzare in cellule la presenza di G4 e iM. Mentre il BG4 è stato ampiamente utilizzato per studiare i G4 sia in cancro che in microorganismi, l’applicazione dell’iMab, specifico per gli iM, è stata meno esplorata. Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di visualizzare la formazione di iM nel genoma virale di HSV-1, grazie all’impiego dell’iMab. Studi preliminari in vitro, tramite tecniche di dicroismo circolare, scansione termica differenziale e footprinting chimico, hanno precedentemente identificato 8 sequenze in grado di ripiegarsi effettivamente in iM, localizzate nei promotori dei geni IE. A partire dai dati in vitro, lo step successivo è stato di indagare la presenza delle strutture iM nelle cellule umane infettate da HSV-1, e correlarne la presenza alle diverse fasi del ciclo virale. Tramite immunofluorescenza è stata valutata la presenza degli iM a diverse tempistiche d’infezione. Successivamente, l’immunoprecipitazione della cromatina, seguita da PCR quantitativa (ChIP-qPCR), ha permesso di associare la presenza di iM alle sequenze geniche virali di interesse. La tecnica è stata ottimizzata per l’utilizzo dell’iMab, in quanto non era mai stato precedentemente utilizzato in ChIP. La caratterizzazione degli iM a livello virale ha permesso l’identificazione di nuovi target terapeutici per il trattamento degli herpesvirus, i quali ad oggi sono soggetti a numerosi fenomeni di resistenza ai farmaci, possibilmente migliorando in futuro il trattamento delle patologie correlate.