La transtiretina (TTR) è una proteina globulare tetramerica di 55 kDa prodotta dal fegato e secreta nel plasma dove svolge la funzione di trasporto di tiroxina (T4) e retinolo tramite legame con la retinol binding protein (RBP). La struttura monomerica nativa è costituita da 8 β-filamenti, organizzati in 2 β-foglietti e un elemento ad α-elica. Nella struttura quaternaria della proteina, i monomeri formano un dimero e l’associazione di dimeri andrà a costituire il tetramero in cui si individua un canale idrofobico centrale per il legame di T4. TTR presenta un residuo di cisteina in 10 ed in vivo il 50% della proteina è presente nella forma cisteinilata, in cui Cys10 forma un ponte disolfuro con un residuo di cisteina libero. TTR è anche causa di alcune forme di amiloidosi, patologia che consiste nel deposito a livello sistemico o localizzato di materiale fibrillare. In particolare, questa proteina causa amiloidosi sistemica senile (SSA) nel 25% della popolazione sopra gli 80 anni, mentre i suoi mutanti causano amiloidosi familiare (ATTRv). Questa patologia ereditaria autosomica dominante si manifesta precocemente, principalmente in forma di polineuropatia e cardiomiopatia, innescata dalla deposizione di fibrille amiloidi. Uno dei meccanismi ipotizzati per la formazione degli aggregati fibrillari propone che dopo la dissociazione del tetramero in monomeri non nativi, si abbia la formazione di oligomeri solubili, in grado di aggregare. In vivo, le fibrille di TTR sono composte dal monomero di transtiretina, fibrille di tipo B o da frammenti del monomero, fibrille di tipo A. Tra i principali frammenti individuati, il 49-127 è il più abbondante ed è probabilmente generato dalla proteasi plasmina. Il mutante di TTR V30M, caratterizzato dalla sostituzione della valina in posizione 30 con una metionina, causa polineuropatia da amiloidosi ed è stata trovata una correlazione tra la presenza di aggregati solubili di V30M circolanti e il decorso della malattia. In questo progetto di Tesi, si sono confrontate a livello conformazionale la forma nativa tetramerica e la forma non nativa oligomerica del mutante V30M. L’ipotesi iniziale è che i frammenti presenti nelle fibrille di tipo A si originino dalla proteolisi di forme aggregate di TTR, quali gli oligomeri, da parte di enzimi plasmatici. A questo scopo, la proteina ricombinante TTR-V30M è stata prodotta in collaborazione con il gruppo del Prof. V. De Filippis e cisteinilata a livello di Cys10 (V30M-CYS). Analisi mediante dicroismo circolare e fluorescenza hanno indicato che la cisteinilazione globalmente non altera la struttura della proteina, tuttavia rende il V30M più suscettibile a proteolisi limitata con subtilisina rispetto alla forma ridotta indicando un’aumentata flessibilità nella regione di idrolisi. La forma V30M-CYS è stata poi usata per produrre oligomeri solubili della proteina che sono stati caratterizzati dal punto di vista conformazionale mediante tecnica di scambio idrogeno deuterio (HDX-MS) e proteolisi limitata. L’analisi HDX-MS ha dimostrato che gli oligomeri di V30M-CYS sono specie molto più flessibili rispetto alla forma nativa della proteina. Inoltre, a differenza della forma nativa di V30M-CYS, gli oligomeri sono risultati suscettibili al taglio con tripsina e plasmina producendo il frammento amiloidogenico 49-127. I dati presentati in questo progetto di Tesi supportano quindi l’ipotesi che i frammenti amiloidogenici che costituiscono gli aggregati fibrillari di V30M in vivo si possano formare mediante proteolisi delle forme oligomeriche, molto flessibili. Questo risultato può spiegare perché recentemente la concentrazione degli oligomeri di TTR nel plasma di pazienti affetti da ATTRv da V30M sia stato proposto come un indicatore da usare per la diagnosi della malattia e per predire la risposta dei pazienti alla terapia farmacologica.
Effetti della cisteinilazione sulle caratteristiche conformazionali e sulla propensione all’aggregazione del mutante della transtiretina umana V30M.
ZANINI, CHIARA
2021/2022
Abstract
La transtiretina (TTR) è una proteina globulare tetramerica di 55 kDa prodotta dal fegato e secreta nel plasma dove svolge la funzione di trasporto di tiroxina (T4) e retinolo tramite legame con la retinol binding protein (RBP). La struttura monomerica nativa è costituita da 8 β-filamenti, organizzati in 2 β-foglietti e un elemento ad α-elica. Nella struttura quaternaria della proteina, i monomeri formano un dimero e l’associazione di dimeri andrà a costituire il tetramero in cui si individua un canale idrofobico centrale per il legame di T4. TTR presenta un residuo di cisteina in 10 ed in vivo il 50% della proteina è presente nella forma cisteinilata, in cui Cys10 forma un ponte disolfuro con un residuo di cisteina libero. TTR è anche causa di alcune forme di amiloidosi, patologia che consiste nel deposito a livello sistemico o localizzato di materiale fibrillare. In particolare, questa proteina causa amiloidosi sistemica senile (SSA) nel 25% della popolazione sopra gli 80 anni, mentre i suoi mutanti causano amiloidosi familiare (ATTRv). Questa patologia ereditaria autosomica dominante si manifesta precocemente, principalmente in forma di polineuropatia e cardiomiopatia, innescata dalla deposizione di fibrille amiloidi. Uno dei meccanismi ipotizzati per la formazione degli aggregati fibrillari propone che dopo la dissociazione del tetramero in monomeri non nativi, si abbia la formazione di oligomeri solubili, in grado di aggregare. In vivo, le fibrille di TTR sono composte dal monomero di transtiretina, fibrille di tipo B o da frammenti del monomero, fibrille di tipo A. Tra i principali frammenti individuati, il 49-127 è il più abbondante ed è probabilmente generato dalla proteasi plasmina. Il mutante di TTR V30M, caratterizzato dalla sostituzione della valina in posizione 30 con una metionina, causa polineuropatia da amiloidosi ed è stata trovata una correlazione tra la presenza di aggregati solubili di V30M circolanti e il decorso della malattia. In questo progetto di Tesi, si sono confrontate a livello conformazionale la forma nativa tetramerica e la forma non nativa oligomerica del mutante V30M. L’ipotesi iniziale è che i frammenti presenti nelle fibrille di tipo A si originino dalla proteolisi di forme aggregate di TTR, quali gli oligomeri, da parte di enzimi plasmatici. A questo scopo, la proteina ricombinante TTR-V30M è stata prodotta in collaborazione con il gruppo del Prof. V. De Filippis e cisteinilata a livello di Cys10 (V30M-CYS). Analisi mediante dicroismo circolare e fluorescenza hanno indicato che la cisteinilazione globalmente non altera la struttura della proteina, tuttavia rende il V30M più suscettibile a proteolisi limitata con subtilisina rispetto alla forma ridotta indicando un’aumentata flessibilità nella regione di idrolisi. La forma V30M-CYS è stata poi usata per produrre oligomeri solubili della proteina che sono stati caratterizzati dal punto di vista conformazionale mediante tecnica di scambio idrogeno deuterio (HDX-MS) e proteolisi limitata. L’analisi HDX-MS ha dimostrato che gli oligomeri di V30M-CYS sono specie molto più flessibili rispetto alla forma nativa della proteina. Inoltre, a differenza della forma nativa di V30M-CYS, gli oligomeri sono risultati suscettibili al taglio con tripsina e plasmina producendo il frammento amiloidogenico 49-127. I dati presentati in questo progetto di Tesi supportano quindi l’ipotesi che i frammenti amiloidogenici che costituiscono gli aggregati fibrillari di V30M in vivo si possano formare mediante proteolisi delle forme oligomeriche, molto flessibili. Questo risultato può spiegare perché recentemente la concentrazione degli oligomeri di TTR nel plasma di pazienti affetti da ATTRv da V30M sia stato proposto come un indicatore da usare per la diagnosi della malattia e per predire la risposta dei pazienti alla terapia farmacologica.File | Dimensione | Formato | |
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https://hdl.handle.net/20.500.12608/42432