Sintesi e caratterizzazione di nuove sonde chimiche fluorescenti per la determinazione della concentrazione dello ione calcio nel reticolo endoplasmatico

Calcium ion (Ca2+) is involved in numerous biological events ranging from neurotransmission, muscle contraction, gene transcription, cell division and proliferation, metabolism, and cell motility. To date, several chemical indicators (CIs) and genetically encoded indicators (GECIs) are commercially available for the determination of intracellular [Ca2+]. GECIs have the great advantage that they can be targeted to specific subcellular compartments, but they require invasive procedures for expression in cells that make them not applicable to all cell culture types. In contrast, ICs have rapid, homogeneous, and efficient loading into cell culture but are generally cytosolic and are difficult to target to specific subcellular compartments. My thesis work is placed in this context, where the development, including the synthesis and spectroscopic characterization, of novel fluorescent chemical indicators capable of permeating cell membranes and selectively accumulate in the endoplasmic reticulum (RE) lumen are envisioned. In the design, it has been considered that the probe must be sensitive in the range of [Ca2+] expected in the RE, which is quite high and capable of reaching even values of 1-2 mM. For these reasons, sensors should be developed that, compared with the commercially available Fura-2, have an extremely low affinity for Ca2+, avoiding its saturation at the [Ca2+]RE. In addition, an indicator with ratiometric behavior is preferable so as to minimize the problems commonly associated with intensometric indicators during imaging experiments. Ratiometric indicators, in fact, exhibit an excitation or emission spectral shift between the excitation (or emission) wavelength of the ion-free form and the ion-bound form, allowing the ratio parameter (R) to be calculated by dividing the fluorescence intensity at the two emission or excitation wavelengths. R-ratio analysis makes it possible to obtain concentration-independent measurements of the probe, minimizing some problems that may arise during cell imaging experiments such as heterogeneous loading of the probe, its uneven distribution within cells, possible leakage, photobleaching (decrease in the fluorescence of a fluorophore due to photochemical degradation), and changes in the focal plane of the biological sample under examination. This thesis will carefully describe the strategies applied for the design, the synthetic steps that enabled the production of these probes, and their spectroscopic characterization.

Lo ione calcio (Ca2+) è coinvolto in numerosi eventi biologici che vanno dalla neurotrasmissione, alla contrazione muscolare, trascrizione genica, divisione e proliferazione cellulare, metabolismo e motilità cellulare. Ad oggi, sono commercialmente disponibili diversi indicatori chimici (IC) e indicatori geneticamente codificati (GECI) per la determinazione della [Ca2+] intracellulare. I GECI hanno il grande vantaggio di poter essere indirizzati in specifici compartimenti subcellulari, ma necessitano di procedure invasive per l’espressione nelle cellule che li rendono non applicabili a tutti i tipi di coltura cellulare. Per contro, gli IC hanno un rapido, omogeneo ed efficace caricamento in coltura cellulare ma sono generalmente citosolici e sono difficilmente veicolabili in specifici compartimenti subcellulari. In questo contesto si inserisce il mio lavoro di tesi, dove si prevede lo sviluppo, comprendente la sintesi e la caratterizzazione spettroscopica, di nuovi indicatori chimici fluorescenti in grado di permeare le membrane cellulari e accumulare selettivamente nel lumen del reticolo endoplasmatico (RE). Nella fase di progettazione è stato tenuto in considerazione che la sonda deve essere sensibile nell’intorno di [Ca2+] attesa nel RE, che risulta essere piuttosto elevata e capace di raggiungere anche valori di 1-2 mM. Per questi motivi, è opportuno sviluppare sensori che, rispetto al Fura-2 commercialmente disponibile, abbiano un’affinità per il Ca2+ estremamente ridotta, evitandone la saturazione alle [Ca2+]RE. Inoltre, è preferibile un indicatore con comportamento raziometrico in modo da ridurre al minimo i problemi comunemente associati agli indicatori intensometrici durante gli esperimenti di imaging. Gli indicatori raziometrici, infatti, presentano uno shift spettrale di eccitazione o di emissione tra la lunghezza d’onda di eccitazione (o emissione) della forma libera dallo ione e della forma legata allo ione, consentendo di calcolare il rapporto di fluorescenza (R), dividendo l’intensità di fluorescenza misurata alle due lunghezze d’onda di eccitazione (o emissione). L’analisi del rapporto R permette di ottenere misure indipendenti dalla concentrazione della sonda, minimizzando alcuni problemi che possono insorgere durante gli esperimenti di imaging cellulare come il caricamento eterogeneo della sonda, la sua distribuzione non uniforme all’interno delle cellule, l’eventuale perdita, il photobleaching (diminuzione della fluorescenza di un fluoroforo dovuta alla degradazione fotochimica) e variazioni del piano focale del campione biologico sotto esame. In questo lavoro saranno descritte accuratamente le strategie applicate per la progettazione, i passaggi sintetici che hanno consentito di realizzare queste sonde e la loro caratterizzazione spettroscopica.