Analisi mutazionale del gene STRC mediante tecniche di sequenziamento di seconda e terza generazione in una coorte di pazienti affetti da ipoacusia neurosensoriale

Background. Genetic disorders represent one of the main factors responsible for hearing loss, constituting the cause of approximately 80% of prelingual onset hearing loss. Hundreds of genes involved in the pathogenesis of hearing loss of genetic etiology have been identified: among these is STRC, which is associated with isolated sensorineural hearing loss of mild-moderate degree, with prelingual onset, and autosomal recessive inheritance. STRC encodes the protein stereocilin, responsible for the connection between adjacent stereocilia in the outer hair cells of the inner ear. The presence downstream of a pseudogene, pSTRC, with very high sequence homology (99%) makes the diagnosis of hearing loss associated with the STRC locus more complex: this predisposes to the onset of structural gene rearrangements such as Copy Number Variations (CNV) and conversions genes, and poses significant problems in the genetic analysis of the region. For these reasons, routinely used investigation techniques such as NGS second generation sequencing are characterized by incomplete diagnostic efficiency, favoring the introduction and experimentation of advanced techniques such as Oxford Nanopore third generation sequencing. Objective. The study aims to carry out a phenotypic and genotypic characterization of a cohort of patients with STRC-related hearing loss, with particular reference to complex rearrangements of the STRC gene (gene conversions), and an evaluation of the accuracy of the investigation techniques used. Materials and methods. A cohort of 19 individuals with sensorineural hearing loss with mutations in both alleles of the STRC gene was selected. NGS sequencing of a panel of genes associated with isolated sensorineural hearing loss and bioinformatics research of CNV with Agilent SureCall software were performed in each patient starting from data obtained with NGS; specific investigations were then carried out based on the variants observed, including MLPA with a special kit to search for CNV in the STRC gene locus, NGS sequencing performed with Nextera enrichment protocol on amplicons obtained by LR-PCR specific for the STRC gene, and third-generation Oxford Nanopore sequencing. Results. The phenotypic characteristics of the patients studied were consistent with the information present in the literature, as the majority of individuals presented isolated bilateral sensorineural hearing loss (100%), mild or mild-moderate (58%), and prelingual onset (54%). The genetic analysis identified 36 allelic variants, classified by type in small deletions (6%) and intragenic nucleotide substitutions (42%), large multiexon deletions (44%) and probable gene conversions (8%). The variants were then classified according to the ACMG criteria into pathogenic (75%), likely pathogenic (8%) and of uncertain significance (17%). Conclusions. The results obtained allowed us to consolidate the information available in the literature regarding the phenotypic and genotypic manifestations most frequently associated with STRC-related hearing loss; furthermore, thanks to third-generation sequencing, the breakpoints of a gene conversion in STRC were characterized for the first time. In light of the critical issues associated with the investigation of the genomic region of interest, the results obtained confirmed the validity of the analysis protocol used. However, it should be emphasized that the use of particularly advanced analysis methodologies has become necessary, such as Oxford Nanopore third-generation sequencing, which has proved to be fundamental in the investigation of gene conversions. Consequently, it is not yet possible to introduce the protocol into the diagnostic routine, but it is necessary to consider its employment whenever the first level tests are not sufficient to formulate a correct diagnosis.

Presupposti dello studio. I disordini genetici rappresentano uno dei principali fattori responsabili di perdita di udito. Sono stati individuati centinaia di geni coinvolti nella patogenesi di ipoacusia ad eziologia genetica: tra questi rientra STRC, che si associa ad ipoacusia neurosensoriale isolata di grado lieve-moderato, a trasmissione ereditaria autosomica recessiva. STRC codifica per la proteina stereocilina, responsabile della connessione tra stereociglia adiacenti nelle cellule ciliate esterne dell’orecchio interno. A rendere complessa la diagnosi di ipoacusia associata al locus STRC contribuisce la presenza a valle di uno pseudogene, pSTRC, ad elevatissima omologia di sequenza (99%): ciò predispone all’insorgenza di riarrangiamenti genici strutturali e comporta notevoli criticità nell’analisi genetica della regione. Per tali ragioni, le tecniche di indagine utilizzate di routine quali il sequenziamento di seconda generazione risultano caratterizzate da efficienza diagnostica incompleta, favorendo l'introduzione e la sperimentazione di tecniche avanzate come il sequenziamento di terza generazione. Scopo dello studio. Lo studio è volto a caratterizzare fenotipicamente e genotipicamente una coorte di pazienti affetti da ipoacusia STRC-correlata, con particolare riferimento ai riarrangiamenti complessi del gene STRC (conversioni geniche), valutando al contempo l’accuratezza delle tecniche di indagine utilizzate. Materiali e metodi. È stato selezionato un campione di 19 individui affetti da ipoacusia neurosensoriale recanti mutazioni in entrambi gli alleli del gene STRC. Sono stati eseguiti in ogni paziente il sequenziamento NGS di un pannello di geni associati ad ipoacusia e la ricerca bioinformatica di CNV a partire dai dati ottenuti con NGS; sono stati quindi effettuati approfondimenti specifici in base alle varianti osservate, tra cui MLPA, sequenziamento NGS eseguito con protocollo di arricchimento Nextera su ampliconi ottenuti tramite LR-PCR specifica per il gene STRC, e sequenziamento di terza generazione mediante Oxford Nanopore. Risultati. Le caratteristiche fenotipiche dei pazienti studiati sono risultate coerenti con le informazioni presenti in letteratura, in quanto la maggioranza degli individui presentava ipoacusia neurosensoriale isolata bilaterale (100%), di grado lieve o lieve-moderato (58%), ed insorgenza prelinguale (54%). L’analisi genetica ha invece evidenziato la presenza di 36 varianti alleliche, classificabili in base alla tipologia in piccole delezioni (6%) e sostituzioni nucleotidiche intrageniche (42%), ampie delezioni multiesoniche (44%) e verosimili conversioni geniche (8%). Le varianti sono state poi classificate in base ai criteri dell'American College of Medical Genetics in patogenetiche (75%), verosimilmente patogenetiche (8%) e di significato incerto (17%). Conclusioni. I risultati ottenuti hanno permesso di consolidare le informazioni disponibili in letteratura riguardo le manifestazioni fenotipiche e genotipiche più frequentemente associate all’ipoacusia STRC correlata; inoltre, grazie al sequenziamento di terza generazione, sono stati per la prima volta caratterizzati i punti di rottura di una conversione genica a carico di STRC. Alla luce delle criticità associate all’indagine della regione genomica d’interesse, i risultati ottenuti hanno confermato la validità del protocollo di analisi impiegato. Va comunque sottolineato come si sia reso necessario l’utilizzo di metodologie d’analisi particolarmente avanzate quali il sequenziamento di terza generazione Oxford Nanopore, rivelatosi fondamentale nell’indagine delle conversioni geniche. Di conseguenza, non è ancora possibile introdurre il protocollo nella routine diagnostica, ma è necessario considerarne l’impiego nel caso gli esami di primo livello non si rivelino sufficienti alla formulazione di una corretta diagnosi.