Ridotta suscettibilità al COVID-19 in pazienti con Malattia di Fabry: ruolo della glicosilazione di ACE2 e dell’attività di Catepsina-L

Background and aims Coronavirus disease 2019 (COVID-19), caused by Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), had a pandemic spread starting from the end 2019 after the first case in Wuhan in China and raised intense scientific interest in recent years. The cellular mechanism of viral entry and spreading is based on the binding of the Spike protein of SARS-CoV-2 with the glycosylated form of ACE2 enzyme and the activation of several proteases including Cathepsin-L (Cat-L). Patients with Fabry disease, a rare genetic disorder due to a reduced or altered activity of the α-galactosidase A (α-Gal A) enzyme with progressive accumulation of globotriaosylceramide (Gb3 or GL-3) and derivatives in lysosomes, seem to be protected against COVID-19 and this does not seem to be influenced by the enzyme replacement treatment (ERT). This protection from COVID-19 was initially documented in a multicenter survey involving more than 200 Fabry patients between February and April 2020: among these, only three subjects tested positive for COVID-19, one with mild symptoms and two asymptomatic. These results were later confirmed by a survey carried out on 40 Fabry patients under ERT followed by the Nephrology Unit of the Padua University Hospital, in which only one tested positive with mild symptoms. Considering how the progressive and systemic accumulation of Gb3 and derivatives within lysosomes leads to an impaired endo-lysosomal function, in terms of altered maturation and endo-lysosomal pH, it is reasonable to think that the peculiar intracellular biochemical alteration of Fabry disease provides an unfavorable environment for SARS-CoV-2 infection and replication. Therefore, the aim of this study was to evaluate whether the alterations of primary endo-lysosomal functions induced by Gb3 accumulation, such as glycosylation of the SARS-CoV-2 receptor ACE2 and the activity of proteases essential for the viral entry into cells, such as Cat-L, were able to explain the lower susceptibility to COVID-19 of Fabry patients. Method Protein expression of glycosylated and non-glycosylated ACE2 was evaluated by Western-Blot analysis from lymphomonocytes of 15 adult Fabry patients underERT and 14 healthy controls. Furthermore, Cat-L activity was analyzed by fluorescence assay in plasma samples from both groups. Results Fabry patients show increased levels of non-glycosylated ACE2 (0.80±0.14 d.u. vs. 0.60±0.15, p=0,0009) and reduced Cat-L activity (1.58±0.39 r.f.u. vs. 2.08±0.45, p=0,0032) compared to healthy controls. In addition, healthy subjects have a significantly higher expression of glycosylated ACE2 compared to the non-glycosylated form (0.78±0.13 d.u. vs 0.60±0.15, p<0,0001). Finally, glycosylated/non-glycosylated ACE2 ratio was significantly lower in Fabry patients than in healthy subjects (1.12±0.24 vs 1.33±0.19, p=0.020). Conclusion Although obtained from a small cohort of patients, these data provide a mechanistic rationale for the reduced susceptibility to COVID-19 in Fabry disease patients. In conclusion, Fabry disease can provide a human model to understand how the effects of endo-lysosomal pH, ACE2 glycosylation status, and Cat-L activity can reduce the susceptibility to SARS-CoV-2 infection, suggesting new pharmacological targets for the treatment of COVID-19.

Introduzione La malattia da Coronavirus 2019 (COVID-19), causata dal Coronavirus 2 da sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2), ha avuto una diffusione pandemica a partire dalla fine dell’anno 2019 dopo il primo caso avvenuto a Wuhan in Cina ed è stata oggetto di un intenso interesse scientifico negli ultimi anni. Il meccanismo cellulare di ingresso e diffusione del virus avviene grazie al legame della proteina Spike di SARS-CoV-2 all’enzima ACE2 glicosilato ed all’intervento di diverse proteasi tra cui la Catepsina-L (Cat-L). È stato osservatoche i pazienti affetti da Malattia di Fabry, malattia genetica rara dovuta ad una ridotta o alterata attività dell’enzima α-galattosidasi A (α-Gal A) con progressivo accumulo di globotriaosilceramide (Gb3 o GL-3) e derivati nei lisosomi, sembrano presentare una protezione nei confronti dell’infezione, indipendentemente dalla terapia di sostituzione enzimatica (ERT). Questa protezione da COVID-19 è stata inizialmente documentata in una survey multicentrica che ha coinvolto più di 200 pazienti Fabry tra febbraio ed aprile 2020: tra questi solo tre soggetti sono risultati positivi al COVID-19, di cui uno con sintomatologia lieve e due asintomatici. Questi risultati sono stati in seguito confermati da una survey effettuata su 40 pazienti Fabry in ERT seguiti presso il reparto di Nefrologia dell’Azienda Ospedale-Università di Padova, in cui solo una persona è risultata positiva con sintomi lievi. Considerato come il progressivo e sistemico accumulo di Gb3 e derivati all’interno dei lisosomi porti ad una alterata funzionalità endolisosomiale, in termini di alterata maturazione e pH endolisosomiale, è ragionevole pensare che la peculiare alterazione biochimica intracellulare della Malattia di Fabry fornisca un’ambiente poco favorevole per l’infezione e la replicazione di SARS-CoV-2. Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare se le alterazioni delle funzioni endolisosomiali indotte dall’accumulo di Gb3, compromettendo funzioni endolisosomiali primarie, come la glicosilazione del recettore di SARS-CoV-2, l’ACE2, e l’attività di proteasi essenziali per l’ingresso di SARS-CoV-2 nella cellula, come Cat-L, fossero in grado di spiegare la minore suscettibilità al COVID-19 dei pazienti con Malattia di Fabry. Metodi Nei linfomonociti di 15 pazienti adulti affetti da Malattia di Fabry in ERT e 14 controlli sani è stata valutata, tramite Western-Blot, l’espressione proteica di ACE2 glicosilata e non glicosilata. Inoltre, nel plasma dei pazienti e dei controlli arruolati è stata analizzata l’attività di Catepsina-L con saggio di fluorescenza. Risultati I pazienti Fabry presentano aumentati livelli di ACE2 non glicosilata (0.80±0.14 d.u. vs 0.60±0.15, p=0,0009) e ridotta attività di Catepsina-L (1.58±0.39 r.f.u. vs. 2.08±0.45, p=0,0032) rispetto ai controlli sani. Inoltre, i soggetti sani presentano un valore di ACE2 glicosilata significativamente più elevato rispetto alla forma non glicosilata (0.78±0.13 d.u. vs 0.60±0.15, p<0,0001). Infine, il rapporto ACE2 glicosilata/non glicosilata risulta significativamente minore nei pazienti Fabry rispetto ai soggetti sani (1,12±0,24 vs 1,33±0,19, p=0,020). Conclusioni Sebbene questi dati siano stati ottenuti da una piccola coorte di pazienti, forniscono un razionale meccanicistico per la ridotta suscettibilità al COVID-19 nei pazienti affetti da Malattia di Fabry. In conclusione, la Malattia di Fabry può fungere da modello umano per comprendere come gli effetti del pH endolisosomiale, dello stato di glicosilazione di ACE2 e dell'attività della Catepsina-L possano ridurre la suscettibilità all’infezione da SARS-CoV-2, suggerendo nuovi target farmacologici per il trattamento del COVID-19.