La fibrosi cistica è una patologia genetica autosomica recessiva, causata da mutazioni del gene codificante per una particolare proteina che funge da canale anionico, principalmente per lo ione cloruro. Quando correttamente espresso, il ruolo fisiologico di tale canale è quello di regolare la composizione ed il volume delle secrezioni esocrine; nei soggetti malati, invece, queste mutazioni provocano uno squilibrio elettrolitico che influisce negativamente sul trasporto di sodio ed acqua attraverso le membrane cellulari, motivo per cui ne risultano, in particolare a livello polmonare, secrezioni maggiormente dense e viscose. Il DNA extracellulare è una delle sostanze più presenti nello sputum dei pazienti, di origine sia endogena per la degradazione dei neutrofili che esogena in virtù dei patogeni presenti nel tratto respiratorio: questo materiale genetico contribuisce al peggioramento delle proprietà reologiche del muco a causa delle interazioni con le mucine. La rhDNasi I è un’endonucleasi ricombinante umana, utilizzata per via inalatoria come agente mucolitico al fine di ridurre la viscosità del muco, facilitandone l’eliminazione e migliorando la funzionalità polmonare. La velocità di inattivazione, la penetrazione variabile nelle basse vie aeree e la necessità di standardizzare maggiormente l’efficacia nei pazienti sono alcune delle motivazioni alla base della sintesi di coniugati polimerici di questo enzima. In questo progetto di tesi sono stati formulati e sintetizzati diversi coniugati di rhDNasi I con PEG, al fine di valutare l’impatto di strategie di coniugazione diverse in termini di via sintetica, di dimensioni del polimero impiegato e di differenti gradi di coating polimerico. Per la sintesi dei coniugati sono stati impiegati cinque diversi PEG, che si distinguono per il peso molecolare ed il gruppo funzionale all’estremità reattiva. Sono stati sintetizzati sei coniugati in maniera random alle lisine presenti nella sequenza amminoacidica, rispettivamente con PEG-aldeide di varia grandezza (2, 5 e 10 kDa) ed un PEG-NHS monodisperso di 25 monomeri, ed un coniugato è stato preparato modificando in modo sito-specifico il residuo all’N-terminale con un PEG-aldeide di circa 20 kDa. La purificazione dei coniugati è stata eseguita con cromatografia ad esclusione molecolare, mentre per la loro caratterizzazione si è ricorso ad SDS-PAGE e SEC-HPLC. I coniugati con PEG a minor peso molecolare sono stati più accuratamente caratterizzati anche mediante spettrometria di massa MALDI-TOF. Una valutazione sulla stabilità della struttura secondaria a seguito delle diverse strategie di coniugazione è stata realizzata ricorrendo al dicroismo circolare. L’attività dei coniugati è stata determinata mediante saggio di Kunitz ed è stata valutata qualitativamente con un saggio di digestione di un plasmide tramite il monitoraggio dell’attività endonucleasica tempo-dipendente in gel di agarosio. Quanto ottenuto in questo progetto di tesi dimostra quanto potenziale possa esservi nella PEGilazione di proteine terapeutiche in termini di diversità dei coniugati ottenibili, che andrebbero in futuro messi alla prova con condizioni più simili al quadro clinico.
Sviluppo di coniugati polimerici per il delivery polmonare di desossiribonucleasi I nel trattamento della fibrosi cistica
MJIDE, ANDRÉ KEANU
2022/2023
Abstract
La fibrosi cistica è una patologia genetica autosomica recessiva, causata da mutazioni del gene codificante per una particolare proteina che funge da canale anionico, principalmente per lo ione cloruro. Quando correttamente espresso, il ruolo fisiologico di tale canale è quello di regolare la composizione ed il volume delle secrezioni esocrine; nei soggetti malati, invece, queste mutazioni provocano uno squilibrio elettrolitico che influisce negativamente sul trasporto di sodio ed acqua attraverso le membrane cellulari, motivo per cui ne risultano, in particolare a livello polmonare, secrezioni maggiormente dense e viscose. Il DNA extracellulare è una delle sostanze più presenti nello sputum dei pazienti, di origine sia endogena per la degradazione dei neutrofili che esogena in virtù dei patogeni presenti nel tratto respiratorio: questo materiale genetico contribuisce al peggioramento delle proprietà reologiche del muco a causa delle interazioni con le mucine. La rhDNasi I è un’endonucleasi ricombinante umana, utilizzata per via inalatoria come agente mucolitico al fine di ridurre la viscosità del muco, facilitandone l’eliminazione e migliorando la funzionalità polmonare. La velocità di inattivazione, la penetrazione variabile nelle basse vie aeree e la necessità di standardizzare maggiormente l’efficacia nei pazienti sono alcune delle motivazioni alla base della sintesi di coniugati polimerici di questo enzima. In questo progetto di tesi sono stati formulati e sintetizzati diversi coniugati di rhDNasi I con PEG, al fine di valutare l’impatto di strategie di coniugazione diverse in termini di via sintetica, di dimensioni del polimero impiegato e di differenti gradi di coating polimerico. Per la sintesi dei coniugati sono stati impiegati cinque diversi PEG, che si distinguono per il peso molecolare ed il gruppo funzionale all’estremità reattiva. Sono stati sintetizzati sei coniugati in maniera random alle lisine presenti nella sequenza amminoacidica, rispettivamente con PEG-aldeide di varia grandezza (2, 5 e 10 kDa) ed un PEG-NHS monodisperso di 25 monomeri, ed un coniugato è stato preparato modificando in modo sito-specifico il residuo all’N-terminale con un PEG-aldeide di circa 20 kDa. La purificazione dei coniugati è stata eseguita con cromatografia ad esclusione molecolare, mentre per la loro caratterizzazione si è ricorso ad SDS-PAGE e SEC-HPLC. I coniugati con PEG a minor peso molecolare sono stati più accuratamente caratterizzati anche mediante spettrometria di massa MALDI-TOF. Una valutazione sulla stabilità della struttura secondaria a seguito delle diverse strategie di coniugazione è stata realizzata ricorrendo al dicroismo circolare. L’attività dei coniugati è stata determinata mediante saggio di Kunitz ed è stata valutata qualitativamente con un saggio di digestione di un plasmide tramite il monitoraggio dell’attività endonucleasica tempo-dipendente in gel di agarosio. Quanto ottenuto in questo progetto di tesi dimostra quanto potenziale possa esservi nella PEGilazione di proteine terapeutiche in termini di diversità dei coniugati ottenibili, che andrebbero in futuro messi alla prova con condizioni più simili al quadro clinico.File | Dimensione | Formato | |
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https://hdl.handle.net/20.500.12608/47620