Il ruolo della proteina ribosomiale S6 fosforilata nella diagnosi patologica di rigetto anticorpo-mediato nel trapianto di polmone

Background of the study: Antibody-mediated rejection is a fearsome complication in lung transplantation, whose diagnosis is difficult and requires a multidisciplinary approach. From pathological point of view, there are some histological features which can help the diagnosis (such as organizing pneumonia, diffuse alveolar damage, capillary inflammation, endothelialitis and alveolar septal widening), however they are not specific. Another useful parameter in the diagnostic algorithm is C4d staining, however it has poor sensitivity, therefore pulmonary antibody-mediated rejection is still difficult to diagnose. In previous studies, it has been seen that the phosphorylated S6 ribosomal protein (p-S6RP, a key protein of mTOR pathway) is correlated with de novo donor-specific antibodies in lung transplantation. Aim of the study: The objective of this study is to evaluate the role of phosphorylated S6 ribosomal protein (p-S6RP) expression as a surrogate for antibody-mediated rejection diagnosis in lung transplant patients. Materials and methods: This multicentre retrospective study analysed transbronchial biopsies from 216 lung transplanted patients, 114 with antibody-mediated rejection and 102 without (19 with acute cellular rejection, 17 with ischemia/reperfusion injury, 18 with infection, and 48 without post-transplant complications). Immunohistochemistry (IHC) was performed in all transbronchial biopsies (TBB) in order to quantify p-S6RP expression in different cellular types: macrophages, epithelium and endothelium. Each of them received a score from 0 to 3 according to the staining extension [0: no staining; 1: focal staining (only in one sample); 2: multifocal staining (in half the samples); 3: diffuse staining (in all samples)]. Combining all the cellular types’ scores, a total score is obtained. All the scores are then dichotomized into positive versus negative (≥1 vs 0 and 3 vs <3). A total score of 7 was considered a good cut-off point, since it means that p-S6RP is expressed in all cell components, with at least one of them with a score of 3 and one with a score of 2 or more (3+3+1 or 3+2+2). Using this cut-off, the prognostic role of p-S6RP was also evaluated in terms of CLAD-free and overall survival. Biopsies were evaluated by four expert lung pathologists and inter-pathologist agreement between two of them was also evaluated. Results: p-S6RP expression values has resulted higher in AMR rejection cases than in controls for all cell components. The highest sensitivity was in macrophages (0.9), and the highest specificity was in endothelial expression (0.8). Inter-pathologist agreement was moderate for macrophages and endothelium, and higher agreement was found when PS6RP expression was dichotomized into positive/negative. AMR rejection certainty levels increased by 25% once p-S6RB was included in the diagnostic algorithm. Moreover, p-S6RP ≥ 7 was associated with a significant lower CLAD-free and overall survival, independently of the pathological group. Conclusions: The study supports the role of the mTOR pathway in antibody-mediated rejection-related graft injury and suggests that tissue phosphorylation of S6 ribosomal protein could be a useful surrogate for a more accurate pathological diagnosis of lung antibody-mediated rejection.

Presupposti dello studio: Il rigetto anticorpo-mediato (AMR) è una complicanza temibile del trapianto di polmone, la cui diagnosi è tuttora complessa e richiede un approccio multidisciplinare. In ambito patologico, ci sono alcune caratteristiche istologiche che possono aiutare nella diagnosi (come ad esempio: polmonite in organizzazione, danno alveolare diffuso, infiammazione capillare, endotelialite e ispessimento settale alveolare), tuttavia queste lesioni non sono specifiche. Un altro parametro utile nell’algoritmo diagnostico di AMR è il C4d, che però risulta avere scarsa sensibilità, rendendo difficile la diagnosi di AMR. In studi precedenti, si è visto come la proteina ribosomiale S6 fosforilata (p-S6RP, una proteina chiave nella pathway d’attivazione di mTOR) sembri essere correlata con la formazione de novo di anticorpi specifici anti-donatore in pazienti sottoposti a trapianto di polmone. Scopo dello studio: L’obiettivo dello studio è di valutare l’adeguatezza della proteina ribosomiale fosforilata S6 come parametro nella diagnosi di rigetto anticorpo-mediato. Materiali e metodi Si tratta di uno studio multicentrico e retrospettivo, che ha previsto la raccolta e l’analisi di 216 biopsie transbronchiali di pazienti sottoposti a trapianto di polmone, 114 delle quali in corrispondenza della diagnosi di rigetto anticorpo-mediato (AMR) e 102 ottenute da pazienti che non hanno sviluppato AMR nel follow-up considerato (19 con rigetto acuto cellulo-mediato, 17 con danno da ischemia-riperfusione, 18 con infezione e 48 senza complicanze del post-trapianto). In ogni biopsia è stata usata l’immunoistochimica per quantificare la presenza di p-S6RP in diversi tipi cellulari: macrofagi, epitelio ed endotelio. Per ogni tipo cellulare è stato assegnato un punteggio che va da 0 a 3 (0: assenza di staining; 1: staining focale, presente solo in un frustolo; 2: staining multifocale, presente in metà dei frustoli; 3: staining diffuso, presente in tutti i frustoli). Facendo poi la somma degli score dati a ciascun parametro, si è ottenuto uno score totale, che è stato dicotomizzato con anche gli score singoli in due modalità: positivo (≥ 1) e negativo (0), ma anche positivo (3) e negativo (<3). Come cut-off soddisfacente è stato considerato uno score totale di 7, perché indicativo dell’espressione di p-S6RP in tutte le componenti cellulari, di cui almeno una con score 3 e una con score 2 o superiore (es. 3+3+1 o 3+2+2). Con lo stesso cut-off, sono stati confrontati i vari gruppi di AMR riguardo la sopravvivenza legata a CLAD e generale. Le biopsie sono state valutate da quattro patologi esperti in ambito polmonare ed è stata valutata anche la concordanza inter-patologi tra due di questi. Risultati: L’espressione di p-S6RP è risultata più elevata nei casi con AMR rispetto ai controlli in tutte le componenti cellulari. La maggior sensibilità si è trovata nei macrofagi (0.9), mentre la maggior specificità è stata riscontrata nell’endotelio (0.8). Il consenso tra i patologi è risultato moderato per macrofagi ed endotelio, ed è aumentato quando l’espressione di PS6RP è stata espressa come variabile dicotomica (positiva/negativa). Con l’inserimento della valutazione di PS6RP nell’algoritmo diagnostico, il grado di certezza di rigetto AMR è aumentato del 25%. È stato osservato che un valore di p-S6RP ≥ 7 correla in maniera significativa con una più bassa sopravvivenza sia generale, che legata a CLAD, indipendentemente dal gruppo patologico. Conclusioni: Lo studio ha confermato il ruolo della pathway di mTOR nel rigetto anticorpo-mediato e che p-S6RP può essere considerata un parametro utile nell’algoritmo diagnostico di AMR.