Costruzione e validazione di una nuova sonda ricombinante basata sulla proteina splitGFP e modulabile in termini di intensità di fluorescenza

La proteina split GFP è una proteina GFP mutagenizzata e divisa in due porzioni non fluorescenti, il frammento GFP1-10 e il frammento β11. Quando i due frammenti vengono a trovarsi ad una opportuna distanza che consente loro di interagire, vanno spontaneamente incontro ad un processo di complementazione, che dà origine alla ricostituzione della fluorescenza della proteina GFP originale. Questo sistema è stato originariamente sviluppato per studiare l'interazione tra due proteine di interesse alle quali veniva fuso ciascuno dei due frammenti della split GFP. Nel corso degli anni la split GFP è stata utilizzata in numerose altre applicazioni che vanno dallo studio dei contatti tra i diversi organelli cellulari, alla distribuzione e traslocazione di proteine in diversi compartimenti subcellulari, allo studio dei processi di fusione delle membrane cellulari e altro ancora. Lo scopo della mia attività di tirocinio è stato sviluppare alcune varianti di split GFP che presentassero il frammento β11 in copia multipla, 1X, 3X e 7X, e verificare se ci fosse una relazione tra l'intensità di emissione di fluorescenza e il numero di copie dei frammenti β11. La disponibilità di sonde split GFP modulabili in termini di segnale di fluorescenza rappresenta un importante vantaggio per studiare le interazioni tra macromolecole biologiche (proteine e acidi nucleici) che avvengono con diversa affinità.