Utilizzo di CRISPR/Cas9 come strumento per la generazione di fibroblasti murini knockout per il gene Atad3a

Negli ultimi decenni è stata studiata una famiglia di proteine mitocondriali con dominio ATPasico, la famiglia ATAD3, costituita dai tre membri ATAD3A, ATAD3B e ATAD3C, di cui gli ultimi due si sono generati come conseguenza di una doppia duplicazione genica in tandem a partire dal gene ancestrale Atad3a. Gli studi sulle proteine ATAD3B e ATAD3C sono ancora agli albori, sia per quanto riguarda struttura e topologia che per le possibili funzioni correlate. Per quanto concerne la proteina ATAD3A, invece, è già stato suggerito il suo coinvolgimento nella funzionalità mitocondriale, con conseguenze che si ripercuotono a livello di intero organismo: mutazioni del gene Atad3a, infatti, sono causa di morte prenatale, nonché di anomalie nello sviluppo embrionale e nella morfologia e funzione mitocondriale. La difficoltà nello studio della funzione di questa proteina deriva dal fatto che la sua ablazione in modelli murini porta a letalità embrionale, e ciò ne complica inevitabilmente lo studio anche negli individui umani che presentano mutazioni per ATAD3A. Solo recentemente sono stati generati modelli animali KO condizionali tessuto specifici, che hanno fornito nuovi dettagli sulla funzione di ATAD3A. Tuttavia, per caratterizzare la funzione di questa proteina a livello molecolare è necessario un modello cellulare KO per Atad3a, il quale risulterebbe utile anche al fine di chiarire il ruolo di ATAD3B. In questa tesi, viene illustrata la metodica per l’ottenimento di linee cellulari murine KO per il gene Atad3a con l’ausilio dell’innovativa tecnologia CRISPR/Cas9, che permette di operare un taglio a livello di dsDNA nel preciso locus genico designato. L’obiettivo, in seguito, sarà quello di poter investigare gli effetti che comporta l’assenza di questa proteina, così importante per la vita, anche a livello di singola cellula.