Ligandi G-quadruplex ed inibitori della poli-ADP ribosio polimerasi (PARPi) come possibili target terapeutici per il mastocitoma canino: amici o nemici?

Mast cell tumour (MCTs) is one of the most frequent skin malignant cancers diagnosed in dogs. Through this study, in which the Alamar Blue assay was exploited, the cytotoxicity of two drug molecules, olaparib and AQ1, tested individually and in combination, has been evaluated on the established canine C2 mastocytoma cell line. Prior studies evaluated guanine sequences (G quadruplex) located in the promoter region of numerous oncogenes, like c-KIT , as new potential targets for anticancer therapy. It has previously been established that AQ1, an anthraquinones derivate, is able to bind and to stabilize those sequences in the KIT promoter region. The outcome of this effect is a block of the synthesis of KIT mRNA and the respective protein, preventing cell proliferation. Using the same cytotoxicity assay, the c ytotoxicity of olaparib, a poly ADP ribose polymerase (PARP) inhibitor, has been evaluated on the same cell line. However, olaparib has not been approved by EMA for the treatment of hematopoietic neoplasms yet. PARP inhibitors not only are able to inhibit the DNA repa ir mechanism in cancer cells, which results in an instability of the DNA structure , but they are also capable of binding some G quadruplexes. Olaparib was cytotoxic after 72 hours of incubation, and the effect was higher after 96 and 120 hours of exposure. Nevertheless, the obtained dose response curve was not a typical sigmoid curve, so it was not possible to assess the 50% inhibiting concentration of cells proliferation (IC 50 ). During the second phase of this project, the cytotoxicity caused by the assoc iation of AQ1 and olaparib has been evaluated. The aim was to reduce the therapeutic dose of those two drugs, for decreasing the side effects reported by other studies. The mechanisms of their possible interaction were here only hypothesized. A significant increase of the cytotoxicity (P<0,05) has been observed in cells incubated for 72 hours with a combination of olaparib 2,5 µM and AQ1 0,33 µM, 0,65 µM and 1,3 µM, compared with the effect observed after the exposure of cells to olaparib alone at a concentration of 2,5 µM. By exposing cells to higher concentrations of olaparib (5 µM), a significant increase in the cytotoxicity (P<0,05) was observed only with the addition of AQ1 0,33 µM and 0,65 µM, compared with the treatment with AQ1 alone. No significant increase in cytotoxicity was observed using olaparib 10 µM. Additional studies are needed to better determine the nature of the interaction between olaparib and AQ1 (antagonistic, synergistic, or additive effect), to explain the trend of the dose response curve obtained by a single treatment with olaparib and its variations when used in combination with other drugs. Investigat ions on KIT and BRCA mutations on the C2 are also required.

Il mastocitoma è uno dei tumori cutanei maligni più frequenti nel cane. Nel corso della presente tesi è stata valutata la citotossicità di due molecole, olaparib e AQ1, impiegate singolarmente e in combinazione, in una linea cellulare stabilizzata di mastocitoma canino (C2). Studi condotti precedentemente hanno individuato come potenziali target terapeutici antineoplastici alcune sequenze ripetitive di guanina (G-quadruplex) situate nella regione promotoriale di diversi protooncogeni, tra cui KIT. Conseguentemente, sono stati indagati, mediante l’esecuzione del test per l’Alamar Blue, gli effetti citotossici di un ligando di questi G-quadruplex, l’AQ1. Questo derivato antrachinonico è in grado di stabilizzare tali sequenze nella regione promotoriale di KIT, con conseguente blocco della sintesi di mRNA e delle relative proteine codificate da questo gene, impedendo alle cellule tumorali di proliferare. Tramite lo stesso test sono stati valutati gli effetti citotossici dell’olaparib, un inibitore delle poli-ADP-ribosio polimerasi (PARP), tuttora non approvato dall’EMA per la terapia delle neoplasie ematopoietiche. I PARP inibitori, oltre ad inibire i meccanismi di riparo del danno al DNA delle cellule neoplastiche, rendendolo così instabile, sono in grado di legare anche alcuni G-quadruplex. L’olaparib è risultato essere citotossico a partire da 72 ore di incubazione, con un aumento della percentuale di citotossicità dopo 96 e 120 ore di incubazione; purtuttavia, non è stato possibile ottenere il tipico andamento sigmoide della curva dose-risposta e determinare la relativa concentrazione inibente per un 50% la proliferazione cellulare (IC50). Successivamente, è stata valutata la citotossicità dell’associazione olaparib ed AQ1, allo scopo di ridurne la dose e dunque gli effetti collaterali evidenziati in altri studi. Si è quindi valutata una loro possibile interazione, i cui meccanismi sono solo stati ipotizzati. Un significativo aumento della citotossicità (P<0,05), rispetto alle cellule incubate con solo olaparib 2,5 μM, è stato osservato a 72 ore di incubazione per le combinazioni di olaparib 2,5 μM e AQ1 0,33 μM, 0,65 μM e 1,3 μM. Impiegando concentrazioni più elevate di olaparib (5 μM), un aumento significativo della citotossicità (P<0,05), è stato riscontrato solo nelle combinazioni che prevedevano concentrazioni di AQ1 pari a 0,33 μM e 0,65 μM rispetto alle medesime utilizzate singolarmente. Nel caso invece delle combinazioni con olaparib 10 μM, l’aumento di citotossicità delle combinazioni non è risultato significativo in nessun caso. Sono necessarie ulteriori indagini per meglio definire non solo la natura dell’interazione tra olaparib e AQ1 (effetto additivo, sinergismo, antagonismo), ma anche per descrivere i meccanismi d’azione dell’olaparib in monoterapia ed in combinazione, prendendo in dovuta considerazione anche il profilo mutazionale (e.g., KIT, BRCA) della linea cellulare oggetto di studio.