Development of a chemical toolbox to unveil the mechanism of action of the CFTR corrector C17 in sarcoglycanopathy and identify its molecular target(s)

Sarcoglycanopathies are rare muscular dystrophies with recessive autosomic transmission characterized by a progressive weakening of proximal muscles in the hips, shoulders, and abdomen with an early onset that can lead to loss of deambulation. Moreover, important complications, such as respiratory failure and cardiomyopathy, can occur. Sarcoglycanopathies belong to the family of Limb-Gridle Muscular Dystrophies (LGMD) and are caused by mutations on the genes encoding for the membrane protein α-, β-, γ-, δ-sarcoglycan. These proteins form a tetrameric sub-complex at the sarcolemma linked to the major Dystrophin-Associated Protein Complex (DAPC) that has the main role of connecting the myocellular cytoskeleton to the extracellular matrix; the loss of even just one DAPC component renders the sarcolemma more prone to be damaged, with a consequent degeneration of the myofibrils. The majority of sarcoglycanopathies are associated with missense mutations that generate substitution of single amino-acids that could lead to protein misfolding. Such misfolded proteins, even if still potentially functional, are recognized by the Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation (ERAD) system and eliminated through proteasomal degradation. The result is a reduced or absent localization of the tetramer at the membrane and in association with the DAPC. Lacking specific treatments, different attempts were made to find new therapeutic approaches and the cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) corrector C17 showed an interesting activity in lowering total levels of misfolded sarcoglycans, but also an increase in the membrane localization of the tetramer. Different studies in Prof. Sandonà’s research group (Department of Biomedical Sciences of the University of Padova) confirmed the efficacy of the CFTR corrector C17 in stably recovering mutated α-SG at its functional localization, proving it to be a promising hit compound by means of in vitro and in vivo studies. Despite the very promising results obtained with C17, there is currently no information available on its mechanism of action. During my thesis internship, a set of chemical tools analogues of C17 have been designed and synthesized, with the aim of discover the target protein(s) responsible for its activity, the binding site, and possibly gain insight into its mechanism of action. In particular, the following compounds were synthesized: a photo-affinity label (PAL) C17 analogue, based on a diazirine photoreactive group, for drug target identification in cell culture; a fluorescent C17 analogue, based on a small nitrobenzoxadiazol (NBD) fluorophore, for localization fluorescence microscopy experiments; a C17 functionalized SepharoseTM (STM) 4 Fast Flow resin for isolation/identification of interacting protein(s) through affinity chromatography of cell lysates; and finally two C17 derivatives based on proteolysis-targeting chimera (PROTAC) technology for target protein(s) degradation. The synthesized molecules are currently undergoing biological evaluation to assess their ability to unveil important insights into the biological activity of C17 in α- sarcoglycanopathies. Understanding the mechanism behind the biological activity of this compound could help develop more potent molecules for the treatment of this disease.

Le sarcoglicanopatie sono rare distrofie muscolari con trasmissione autosomica recessiva caratterizzata da un progressivo indebolimento dei muscoli prossimali di fianchi, spalle e addome con un inizio precoce che può portare alla perdita di deambulazione. Inoltre, possono verificarsi complicazioni importanti, come insufficienza respiratoria e cardiomiopatia. Le sarcoglicanopatie appartengono alla famiglia Distrofie Muscolari degli Arti (LGMD) e sono causate da mutazioni sui geni che codificano per la proteina di membrana α-, β-, γ-, δ-sarcoglicano. Queste proteine formano un sub-complesso tetramerico nel sarcolemma che è legato al complesso proteico maggiore associato alla distrofina (DAPC) che ha il ruolo principale di collegare il citoscheletro miocellulare alla matrice extracellulare; la perdita anche di un solo componente del DAPC rende il sarcolemma più soggetto ad essere danneggiato, con conseguente degenerazione delle miofibrille. La maggior parte delle sarcoglicanopatie sono associate a mutazioni missenso che generano una sostituzione di singoli residui amminoacidici che possono dare origine a ripiegamenti innaturali della proteina. Queste proteine mal ripiegate, anche se ancora possibilmente funzionanti, vengono riconosciute dal sistema di degradazione associato al reticolo endoplasmatico (ERAD) ed eliminate attraverso degradazione proteosomica. Il risultato è una riduzione o assente localizzazione del tetramero nella membrana e in associazione con il DAPC. In assenza di trattamenti specifici, sono stati fatti diversi tentativi per trovare nuovi approcci terapeutici ed il correttore CFTR C17 ha mostrato un'attività interessante nell'abbassamento dei livelli totali sarcoglicani mal ripiegati, ma anche un aumento della localizzazione del tetramero in membrana. Diversi studi del gruppo di ricerca della Prof.ssa Sandonà (Dipartimento di Scienze Biomediche dell’Università di Padova) hanno confermato l'efficacia del correttore CFTR C17 nel recupero stabile del α-SG mutato nella sua localizzazione funzionale, dimostrando che è un promettente composto hit da studiare in vitro e in vivo. Nonostante i risultati molto promettenti ottenuti con C17, non ci sono attualmente informazioni disponibili sul suo meccanismo di azione. Durante il mio internato di tesi, un insieme di strumenti chimici analoghi di C17 sono stati progettati e sintetizzati, con l'obiettivo di scoprire la proteina(e) bersaglio responsabile per la sua attività, il sito di legame, e possibilmente di ottenere indicazioni sul suo meccanismo di azione. In particolare, sono stati sintetizzati i seguenti composti: un photo-affinity label (PAL) derivato di C17, basato su un gruppo diazirinico fotoreattivo, per l’identificazione del target del farmaco in coltura cellulare; un derivato di C17 fluorescente, basato sul piccolo fluoroforo nitrbenzodiazolo (NBD), per esperimenti di localizzazione tramite microscopia a fluorescenza; una resina SepharoseTM (STM) 4 Fast Flow funzionalizzata con C17 per l’isolamento/identificazione di proteine interagenti attraverso cromatografia di affinità di un lisato cellulare ed infine due derivati di C17 basati sulla tecnologia proteolysis-targeting chimera (PROTAC) per la degradazione delle proteine bersaglio. Le molecole sintetizzate si trovano attualmente in fase di valutazione biologica per determinare la loro capacità di svelare importanti informazioni sull'attività biologica di C17 nelle α-sarcoglicanopatie. Comprendere il meccanismo che sta alla base dell'attività biologica di questo composto potrebbe aiutare a sviluppare molecole più potenti per il trattamento di questa malattia.