Approcci di targeting per impedire la formazione del complesso Vimentina - G4 repeats

Vimentina è una proteina citoscheletrica che appartiene alla classe III dei filamenti intermedi (IFs). Come tale, essa possiede molteplici funzioni strutturali e fisiologiche ma, tra queste, risulta più rilevante ai fini di questo progetto il ruolo che Vimentina svolge nella transizione epiteliale-mesenchimale (EMT). L'EMT è una delle driving forces che promuovono l'invasione cellulare, supportando così le metastasi in diversi tipi di tumori. Inoltre, è stato osservato che Vimentina è in grado di riconoscere strutture G4 repeats, con maggior affinità rispetto ai G-quadruplex singoli. I G-quadruplex sono strutture secondarie non canoniche del DNA che si formano in sequenze nucleotidiche particolarmente ricche di guanine. Queste peculiari strutture si trovano ad esempio a livello telomerico o nei promotori di molti oncogeni dove fungono da regolatori della trascrizione. I G4 repeats derivano dal riconoscimento di più strutture G-quadruplex che possono formarsi nelle vicinanze in un singolo sito genomico. Vimentina nella sua forma tetramerica è in grado di riconoscere i G4 repeats con affinità nanomolare e il dominio proteico coinvolto in questa interazione è l’N-terminale. Lo scopo di questo progetto di tesi è proporre delle strategie efficaci per bloccare la formazione del complesso Vimentina-G4 repeats. Per questo fine sono state impiegate tre diverse classi di composti: molecole che riconoscono Vimentina, ligandi per i G-quadruplex, sequenze peptidiche derivanti dalla porzione N-terminale della proteina wild-type. Come primo passo si è proceduto alla produzione di Vimentina umana da batteri E. coli (BL21 DE3), opportunamente trasformati con il plasmide pET-24a (+), e alla sua purificazione tramite FPLC, secondo il protocollo di Herrmann e al1. Successivamente mi sono concentrato sul caratterizzare l’attività dei composti sopracitati nei confronti del complesso Vimentina-G4 repeats. Come molecole capaci di interagire con la proteina sono state impiegate Withaferina A e Artesunato. Per entrambi i composti sono state condotte delle analisi preliminari per settare le condizioni di impiego e di reazione. Infine, tramite gel elettroforesi è stato dimostrato che sia Artesunato che Withaferina, andando ad interagire con Vimentina, impediscono al DNA di riconoscerla e di formare il complesso. Inoltre, Artesunato riesce anche spiazzare la proteina stessa del legame con il DNA. Per quanto riguarda i ligandi dei G-quadruplex, invece, le molecole testate in questo lavoro sono BIM-Pr1 e InqPr1. Entrambi hanno dimostrato la capacità di bloccare la formazione del complesso Vimentina-G4 repeats. andando però a legare la sequenza oligonucleotidica coinvolta, seppur con attività differenti. Infatti, BIM-Pr1 è risultato essere più attivo rispetto a InqPr1 nei confronti della sequenza nucleotidica e anche del complesso, come è stato confermato grazie ad analisi di Fluorescence Melting e analisi elettroforetiche. Da ultimo sono state analizzate due sequenze peptidiche derivanti dal dominio N-terminale della proteina, ovvero i segmenti compresi tra gli amminoacidi 11 e 30 e 68 e 79. Tramite analisi di Fluorescent Melting è stato dimostrato che solo il peptide 11-30 possiede la capacità di interagire con il DNA, mentre la sequenza 68-79 no. Questo dato riflette anche la loro capacità di bloccare la formazione del complesso Vimentina-2TEL; infatti, il peptide 11-30 riesce ad impedire al DNA di legarsi alla proteina; la sequenza 68-79, invece, non ha mostrato questo tipo di attività. Impedire la formazione del complesso Vimentina-G4 repeats in vitro rappresenta una possibile strategia per approfondire il ruolo che questa proteina possiede come fattore di regolazione di diverse forme tumorali, soprattutto metastatiche.