VALUTAZIONE DELL’ESPRESSIONE IMMUNOISTOCHIMICA DELLE PROTEINE DEL SISTEMA MISMATCH REPAIR E ANALISI DEL GENE BRAF NEL CARCINOMA COLORETTALE PER RICERCARE LA SINDROME DI LYNCH

Introduzione: Nel panorama oncologico emerge in crescita il carcinoma del colon-retto, al momento terza neoplasia mondiale in entrambi i sessi per incidenza; tra le cause predisponenti alla formazione del carcinoma vi è la Sindrome di Lynch, una malattia ereditaria a carattere non poliposico (non genera polipi nel tessuto coinvolto) con una frequenza del 10%, caratterizzata da una mancanza delle proteine del sistema mismatch repair (MMR), ovvero quelle proteine appartenenti a un meccanismo endogeno presente in ogni cellula, incaricato di riparare eventuali danni all’acido desossiribonucleico (DNA) che si verificano per esempio durante la sua sintesi. Sfortunatamente questa tipologia di carcinoma colorettale ha prognosi peggiore: la recente introduzione della diagnostica immunoistochimica rappresenta senz’altro un marker predittivo utile a rivoluzionare l’approccio terapeutico. Scopo della tesi: Lo scopo di questo studio è la valutazione del profilo immunoistochimico delle proteine del mismatch repair nei campioni di pazienti con diagnosi di carcinoma colorettale metastatico, individuando i quadri di difetti di funzionamento del sistema MMR e di instabilità microsatellitare; queste informazioni vengono utilizzate per indirizzare i pazienti selezionati ad analisi molecolare per confermare o meno la presenza di mutazioni: l’approccio terapeutico sarà più specifico in linea con i principi della medicina personalizzata. Materiali e metodi: La base di partenza è il blocchetto fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) dal quale si ricava una serie di sezioni destinate a colorazione di ematossilina-eosina (EE) che permette una prima valutazione del caso in esame. La tecnica di immunoistochimica consente di valutare la presenza delle proteine del sistema mismatch repair (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) e ultimare la diagnosi ricorrendo alla biologia molecolare nel caso in cui esse siano mancanti. La conferma dell’instabilità microsatellitare che ne consegue si riscontra con la presenza della mutazione V600E nel gene BRAF riconducibile alla sindrome di Lynch: si estrae il materiale genetico dal campione istologico in blocchetto FFPE, si valuta la purezza dell’estratto con elettroforesi su gel di agarosio e si indirizza alla Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) al fine di amplificare la sequenza del gene mutato. Risultati: Grazie alla colorazione immunoistochimica è stato possibile individuare l’espressione dei geni codificanti le proteine MMR e si è riscontrato in più della metà del gruppo di studio un quadro di stabilità microsatellitare, mentre il restante presenta un’instabilità microsatellitare; di questo campione una piccola parte presenta la mutazione V600E al gene BRAF indice della presenza della Sindrome di Lynch, responsabile dello sviluppo di carcinoma colorettale metastatico nell’80-85% dei casi con fattore predittivo fortemente negativo. Questi risultati sono stati ottenuti con la diagnostica molecolare attraverso RT-PCR per identificare le mutazioni puntiformi; l’analisi biomolecolare per individuare la mutazione V600E del gene BRAF è stata performata su DNA estratto dal tessuto tumorale. Conclusioni: Da questo studio è emerso che una minoranza dei pazienti campionati presenta un quadro di instabilità microsatellitare e di questi, una percentuale bassissima, presenta il gene BRAF mutato nell’esone 15 p.V600E. Le metodiche immunoistochimica e molecolari possono essere adoperate insieme per formulare la diagnosi della sindrome di Lynch prima dello sviluppo dei sintomi negli individui a rischio; questi pazienti dovranno essere sorvegliati con follow-up predisposto per i soggetti colpiti geneticamente.