Metodi per il mantenimento e la criopreservazione di una linea di topi geneticamente modificati con un doppio knock-in.

Introduction: Mouse models are a fundamental tool for basic scientific research and for the study of gene function in the wide context of human diseases. The breeding and the use of animals for experimental purposes must, by law, guarantee their psycho-physical well-being and at the same time allow the study of phenotypes in the most reproducible manner as possible. In this work, we deal with the maintenance and cryopreservation of a genetically modified mouse line developed to study - by conditional knockout - the functional role of LATS1 and LATS2 (two genes involved in Hippo signaling pathway), as well as critical aspects and possible implementations of the embryo cryopreservation technique. Materials and methods: Colony maintenance, under optimal conditions, involves mating males and females homozygous for the Lats1fl and Lats2fl alleles. Therefore, all animals are genotyped by extraction of genomic DNA from a tissue biopsy and PCR. For a long term preservation of the genetically modified line, a cryopreservation protocol was performed on the embryos at the morula stage. Results: The genotyping methods applied allowed to maintain the correct combination of genetic modifications over time, maximizing the production of animals with a genotype useful for experimental purposes. The cryopreservation protocol generated a sufficient number of embryos to guarantee the preservation of the transgenic line and to allow for a future rederivation phase (that is the regeneration of the colony from frozen embryos). Conclusions:The breeding, selection of the correct genotypes, mating and cryopreservation methods used are adequate to maintain the colony of model animals in optimal conditions.

Introduzione: I modelli murini costituiscono uno strumento fondamentale per la ricerca scientifica di base e per lo studio della funzione dei geni coinvolti nelle patologie umane. L’allevamento e l’utilizzo di animali a scopo sperimentale deve, a norma di legge, garantire loro il benessere psico-fisico e, al tempo stesso, permettere lo studio dei fenotipi nel modo più riproducibile possibile. In questo lavoro, ci occupiamo del mantenimento e della criopreservazione di una linea murina geneticamente modificata sviluppata per studiare tramite knockout condizionale il ruolo funzionale di due geni contemporaneamente, LATS1 e LATS2, coinvolti nella Hippo signaling pathway, nonché, gli aspetti critici e le possibili implementazioni della tecnica di crioconservazione degli embrioni. Materiali e metodi: Il mantenimento della colonia, in condizioni ottimali, prevede l’incrocio di maschi e femmine omozigoti per gli alleli Lats1fl e Lats2fl. Pertanto tutti gli animali sono sottoposti a genotipizzazione mediante estrazione di DNA genomico da una biopsia di tessuto e PCR. Per la conservazione a lungo termine della linea geneticamente modificata, è stato eseguito un protocollo di criopreservazione degli embrioni allo stadio di morula. Risultati: I metodi di genotipizzazione applicati hanno permesso di mantenere nel tempo la corretta combinazione di modificazioni genetiche, massimizzando la produzione di animali con genotipo utile agli scopi sperimentali. Il protocollo di criopreservazione ha permesso di ottenere un numero di embrioni sufficiente a garantire la conservazione della linea transgenica e consentire un’eventuale fase di riderivazione in futuro (ovvero, la rigenerazione della colonia a partire dagli embrioni congelati). Conclusioni: I metodi di allevamento, selezione dei genotipi corretti, incrocio e criopreservazione utilizzati sono adeguati a mantenere la colonia di animali modello in condizioni ottimali.