Effetto del frammento amiloidogenico 49-127 della transtiretina umana (hTTR) sulla funzione coagulante della -trombina: implicazioni nella patogenesi delle complicazioni trombotiche nell’amiloidosi da hTTR

Introduzione La transtiretina (hTTR) è una proteina plasmatica omo-tetramerica di 55 kDa prodotta principalmente nel fegato e nel cervello, deputata al trasporto di ormoni tiroidei. La hTTR è associata a due tipologie di amiloidosi sistemiche: la SSA (Senile Systemic Amyloidosis), causata dall’aggregazione di hTTR wild type, e l’amiloidosi familiare, causata da mutazioni amminoacidiche puntiformi, che rendono la hTTR più propensa a formare fibrille amiloidi. Nella SSA si formano depositi amiloidi soprattutto a livello cardiaco, responsabili di gravi cardiomiopatie nell’ 1-3% dei pazienti anziani oltre i 75 anni. Oltre all’effetto sulla funzionalità̀ del miocardio, sembra che la generazione e deposizione di fibrille nelle camere cardiache sia correlata all’attivazione non-canonica della coagulazione, con la formazione di trombi intracardiaci e aumentato rischio di infarto del miocardio. Nei pazienti affetti da SSA, è stato evidenziato che i principali costituenti dei depositi amiloidi sono frammenti C-terminali derivanti dalla proteolisi limitata di hTTR e, tra questi, il frammento 49-127 è quello più abbondante. Non è ancora chiara l’identità delle proteasi responsabili della proteolisi di hTTR. E’ stato proposto che proteasi seriniche endogene, come la plasmina e la tripsina, siano le responsabili della proteolisi del tetramero mentre sembrerebbe che la trombina, enzima fondamentale nel processo coagulativo, sia in grado di proteolizzare anche la hTTR in forma oligomerica, uno stato di aggregazione intermedio in cui la proteina si trova prima di formare le vere e proprie fibrille amiloidi. Obiettivo Dal momento che è stato recentemente provato che le fibrille amiloidi composte principalmente da TTR(49-127) nei pazienti con SSA sono in grado di attivare la coagulazione con un meccanismo superficie-dipendente, il presente progetto di tesi ha l’obiettivo di verificare se anche il peptide in forma monomerica sia in qualche modo coinvolto nell’attivazione della coagulazione. In particolare, questo lavoro si focalizza sull’interazione del peptide con la trombina, enzima fondamentale nella cascata coagulativa in quanto responsabile della conversione della fibrina in fibrinogeno. Metodi Il progetto di tesi prevede l’impiego di una combinazione di tecniche biochimiche e biofisiche atte a caratterizzare l’interazione tra la trombina e il peptide TTR(49-127) che porta ad un aumento dell’attività catalitica dell’enzima. Gli esperimenti condotti hanno l’obiettivo di stimare l’affinità tra le due molecole e di mapparne l’interazione. Le tecniche coinvolte sono la cromatografia a fasi inverse, di gel filtrazione e di affinità, la spettroscopia UV-Vis, quella di emissione di fluorescenza, la spettrometria di massa, l’HDX, l’SPR e il dynamic light scattering.