Caratterizzazione di sequenze genomiche identificate quali siti di legame tra DNA e vimentina in cellule tumorali mesenchimali

Vimentina è una proteina che fa parte dei filamenti intermedi a livello citoplasmatico e viene particolarmente espressa nelle cellule mesenchimali. Essa costituisce un importante marker in tumori metastatici e quindi un rilevante target per la terapia antitumorale. Si trova in forma filamentosa o in forma solubile tetramerica. Quest’ultima può essere presente anche a livello nucleare e di recente si è scoperto che essa è in grado di interagire con sequenze di DNA che formano strutture dette G-quadruplex (G4) repeats. I G4 repeats sono motivi dati dalla successione di più strutture G-quadruplex vicine su uno stesso filamento di DNA. I G-quadruplex sono strutture non canoniche del DNA che si formano in sequenze ricche di guanine. Il core della struttura è formato da piani detti tetradi, ciascuno composto da quattro guanine che interagiscono mediante legami di tipo Hoogsteen. I piani sono connessi dai loop e la struttura è stabilizzata da ioni potassio che si posizionano al centro tra un piano e l’altro. A seconda dei filamenti di DNA coinvolti si possono distinguere G-quadruplex inter-molecolari o intra-molecolari. Tramite la tecnica CUT&TAG sono stati mappati a livello genomico i siti di interazione tra vimentina e il DNA. Questi siti sono particolarmente arricchiti in motivi potenzialmente in grado di formare G4 repeats. Lo scopo di questo lavoro di tesi consiste nella validazione e nella caratterizzazione strutturale in vitro di potenziali G4 repeats che si trovano nei siti di interazione di vimentina. Nello specifico sono state prese in esame delle sequenze presenti in regioni in cui si è riscontrata una maggior presenza di vimentina, ovvero a livello centromerico e a livello del q24 del cromosoma 8 nel locus di Myc. Per quanto riguarda le sequenze centromeriche, tramite misure spettroscopiche ed elettroforetiche, si è potuto dimostrare che esse in vitro non formano strutture G-quadruplex e che non riescono a legare vimentina. Probabilmente in vivo vimentina riesce a legare il genoma in questa regione poiché il legame è mediato da altre proteine o poiché in vivo la sequenza riesce ad assumere conformazioni diverse. Relativamente alla sequenza presente nel locus di Myc si è vista invece essere in grado di assumere più conformazioni in vitro. Tra queste una conformazione dimerica, non biologicamente rilevante, e una monomerica in grado di legare vimentina e quindi presumibilmente riconducibile a una G4 repeats. L’interazione di vimentina a livello del locus di Myc potrebbe contribuire alla regolazione dell’espressione dell’oncogene stesso. Di conseguenza la validazione di questo sito apre la strada al design di molecole in grado di interferire con il legame di vimentina portando a delle applicazioni in ambito antitumorale.