Studio dell’Effetto di Mutazioni Patologiche nell’Amiloidosi da Transtiretina Umana Mediante Proteolisi Limitata, Tecniche Spettroscopiche e Spettrometria di Massa Accoppiata a Scambio Idrogeno-Deuterio (HDX-MS)

La Transtiretina (TTR) è una proteina omo-tetramerica di 55kDa che, nella sua forma nativa, è coinvolta nel trasporto di ormoni tiroidei e di retinolo a livello del plasma e del fluido cerebrospinale. Nonostante il suo ruolo a livello fisiologico, TTR è legata all’insorgenza di malattie a base amiloide, come l’amiloidosi familiare (ATTR) e l’amiloidosi sistemica senile (SSA), causate dall’anomala aggregazione di questa proteina. L’insorgenza di ATTR è stata associata ad oltre 100 mutazioni puntiformi che interessano il gene corrispondente ed è legata all’effetto che queste esercitano sulla struttura della proteina. Le mutazioni possono infatti destabilizzare la struttura tetramerica di TTR, favorendo la sua transizione verso una forma monomerica a maggior carattere amiloidogenico e aumentata suscettibilità alla proteolisi. Ciò porta alla generazione di frammenti che sono estremamente amiloidogenici. Alla luce di queste osservazioni, nel laboratorio di ricerca di Chimica delle Proteine del prof. Vincenzo De Filippis è stato studiato l’effetto che alcune tra le più comuni e/o aggressive mutazioni hanno sulla struttura, sulla flessibilità conformazionale e sulla suscettibilità alla proteolisi della transtiretina. A tale scopo, le proteine sono state espresse mediante tecniche di biologia molecolare, purificate tramite cromatografia di affinità e caratterizzate chimicamente tramite spettrometria di massa. Successivamente, mediante l’utilizzo di tecniche di scambio idrogeno deuterio accoppiato a spettrometria di massa (HDX-MS) e di tecniche spettroscopiche, quali fluorescenza, dicroismo circolare e dynamic light scattering, le proteine sono state caratterizzate dal punto di vista conformazionale. Infine, per esplorare come mutazioni nella sequenza amminoacidica di TTR possano influenzarne la suscettibilità alla proteolisi, e quindi il potenziale amiloidogenico, i mutanti sono stati trattati con enzimi proteolitici caratterizzati da distinte specificità di taglio (proteolisi limitata accoppiata a spettrometria di massa, LiP-MS). La combinazione delle tecniche HDX-MS e LiP-MS consente di indagare la dinamica strutturale delle proteine, offrendo una chiara connessione tra mutazioni amminoacidiche, alterazioni conformazionali, stabilità e suscettibilità alla proteolisi. L'impiego combinato di queste tecniche può contribuire allo sviluppo di strategie terapeutiche innovative per i disturbi correlati all'amiloidosi, tramite la comprensione degli effetti delle mutazioni sulla struttura e la funzione di TTR.