Fotostabilità chimico-fisica di anticorpi monoclonali nei diversi diluenti per la somministrazione sistemica

Negli ultimi anni gli anticorpi monoclonali (mAbs) si sono rapidamente diffusi come biofarmaci per il trattamento del cancro, soprattutto per la loro specificità del bersaglio e la stimolazione di risposte antitumorali affidabili. La loro formulazione può risultare potenzialmente instabile se sottoposta a scuotimento, fluttuazioni di temperatura, umidità ed esposizione alla luce interna ed esterna. Tutti questi fattori di stress possono verificarsi durante le varie fasi della vita reale del farmaco, quali la produzione, il trasporto, lo stoccaggio, la manipolazione e somministrazione. L’esposizione alle radiazioni luminose può influire sulla stabilità dei mAbs interagendo con le catene laterali di alcuni aminoacidi della molecola (ad es. triptofano, tirosina, fenilalanina e cisteina). L'energia fornita dalla luce può indurre instabilità chimica - come la fotoossidazione di alcuni amino acidi facilmente ossidabili (Trp, Tyr, Hys, Met, Cys) e la formazione di ditirosine - che si traduce in alcuni casi nella degradazione della proteina e nell'instabilità fisica (ad esempio l'aggregazione delle molecole di anticorpo). Per la maggior parte del tempo, i prodotti a base di mAbs sono conservati all'interno di scatole, frigoriferi e nei veicoli per il trasporto dalla sede di produzione ai magazzini e agli ospedali; pertanto, l'esposizione alla luce si verifica più frequentemente durante la loro formulazione nell’azienda produttrice, la preparazione di soluzioni diluite per la somministrazione endovenosa nella farmacia ospedaliera, durante il trasporto e la somministrazione in reparto effettuati dagli infermieri e, da ultimo, durante il trasporto e la conservazione a casa da parte dei pazienti. In questo progetto di tesi abbiamo studiato la fotostabilità alla luce solare artificiale di Nivolumab diluito in glucosio sterile 5% e NaCl 0.9% alla concentrazione di 1 mg/mL. Queste sono infatti le condizioni di somministrazione ai pazienti. Sono stati quindi eseguiti dei test per valutare una eventuale variazione nella conformazione dell’anticorpo nei diversi diluenti, tramite tecniche spettroscopiche (UV-Vis, dicroismo circolare, fluorescenza), mentre le modifiche chimiche sono state monitorate attraverso spettrometria di massa dopo digestione triptica. È stata posta attenzione ai prodotti di degradazione del glucosio, che possono prodursi durante il processo di sterilizzazione al calore, in particolare il 5-HMF. Questo, se esposto alla luce, può indurre formazione di specie reattive dell’ossigeno, in particolare l’ossigeno di singoletto, specie altamente reattiva in grado di favorire reazioni di ossidazione degli amminoacidi e indurre conseguentemente modifiche fisiche all’anticorpo, come ad esempio l’aggregazione. È stata quindi indagata la formazione di aggregati con tecniche elettroforetiche (SDS-PAGE), Cromatografiche (SEC) e Dynamic light Scattering (DLS). La modifica fisica e chimica dei mAbs può portare non solo alla perdita della loro bioattività, ma anche al potenziamento della loro immunogenicità, per lo più associata all'aggregazione, con aumento del rischio di gravi reazioni di ipersensibilità. Sono stati condotti quindi anche test di attività con un PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay, per valutare la capacità di Nivolumab di riconoscere il suo target cellulare PD-1, una volta sottoposto l’anticorpo agli stress di luce e diluizione, sia in soluzione salina che glucosata sterile e non sterile.