NOP RECEPTOR TRANSDUCEROME: INSIGHTS INTO BIASED AGONISM

G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest family of cell surface receptors known to serve critical roles in a variety of physiological activities. GPCRs mediate their effect preferentially by triggering heterotrimeric G proteins. G proteins are subdivided into four families (i.e., Gi/o, Gs, Gq/11, and G12/13) that modulate the levels of certain second messengers (e.g., cAMP, calcium, etc.) and the activation of other effectors (e.g., Rho A). The NOP receptor (a receptor activated by the endogenous neuropeptide nociceptin/orphanin FQ (N/OFQ)) is the most recently identified member of the opioid receptor family. The NOP receptor is found in important neuronal substrates that modulate pain and reward. In addition, NOP receptors display a ubiquitous distribution, allowing N/OFQ to modulate a variety of physiological processes (centrally and peripherally). As a result, the NOP receptor has received considerable attention as a possible target for the development of ligands with therapeutic promise in a variety of pathological situations. GPCRs can exist in multiple active conformations, leading in turn to different downstream effects and coupling. Biased agonism is a unique paradigm in GPCR signaling that illustrates how various ligands preferentially maintain certain receptor conformations, resulting in the selective activation of certain signaling pathways over others. In this thesis, we aimed to apply a truly innovative approach to study the activation by the (human) NOP receptor of the most relevant inhibitory G proteins (i.e., Gi1, Gi2, Gi3, GoA, and GoB). This approach (i.e., named “trupath”) is based on a bioluminescence resonance energy transfer (BRET) approach allowing to measure the activation/dissociation of these heterotrimeric G proteins. We employed, together with N/OFQ, a panel of 20 different NOP ligands of different natures (peptide and non-peptide), some of which already exhibit a variety of “bias” degrees. N/OFQ displayed with all the G proteins a high value of potency ranging 0.1-1 nM. In addition, most of the compounds tested, when compared to N/OFQ, showed a similar profile across all transducers, and displayed a pharmacological profile close to what observed in previously reported datasets. Observations carried out in this thesis will be very informative for proceeding into a deeper understanding of the mechanism of NOP activation, and in a future perspective, to realize transducer specific medicines.

I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) sono la più grande famiglia di recettori espressi sulla superficie cellulare e svolgono ruoli critici in una varietà di attività fisiologiche. I GPCR mediano i loro effetti preferenzialmente attivando le proteine G eterotrimeriche. Le proteine G sono suddivise in quattro famiglie (Gi/o, Gs, Gq/11 e G12/13) che modulano i livelli di determinati secondi messageri (come il cAMP, il calcio, ecc) e l’attivazione di altri effettori (come Rho A). Il recettore NOP (recettore attivo dal neuropeptide endogeno nocicettina/orfanina FQ (N/OFQ)) è il membro più recentemente identificato della famiglia dei recettori oppioidi. Il recettore NOP si trova in importanti substrati neuronali che modulano il dolore e la ricompensa. Inoltre, il recettore NOP mostra una distribuzione ubiquitaria che consente a N/OFQ di modulare una varietà di processi fisiologici (sia centralmente che perifericamente). Di conseguenza, il recettore NOP ha attirato considerevole attenzione come possibile bersaglio per lo sviluppo di ligandi innovativi in una varietà di condizioni patologiche. I GPCR possono esistere in diverse conformazioni attive, che possono portare, tramite l’accoppiamento a diversi effettori, alla modulazione di diverse vie trasduzionali. L’agonismo “bias” è una proprietà dei ligandi per i GPCR che implica come i diversi agonisti siano in grado di modulare selettivamente specifiche conformazioni del recettore, portando all’attivazione selettiva di determinate vie di segnalazione rispetto ad altre. In questa tesi, abbiamo utilizzato un approccio innovativo per studiare l’attivazione del recettore NOP umano. In particolare, per la sua propensione di attivare le principali proteine G di tipo inibitorio (ossia Gi1, Gi2, Gi3, GoA, GoB). Questo approccio, chiamato “Trupath”, si basa sul trasferimento di energia di risonanza bioluminescente (BRET) ed è in grado di misurare l’attivazione/dissociazione di queste proteine G eterotrimeriche. Nei nostri esperimenti, abbiamo impiegato, insieme a N/OFQ, un panello di 20 diversi ligandi del recettore NOP di natura diversa (peptidici e non peptidici) e alcuni di questi con diversi gradi di “bias”. N/OFQ ha attivato tutte le proteine G studiate con un alto valore di potenza compreso tra 0.1 e 1 nM. Inoltre, la maggiore parte dei composti testati, se confrontati agli effetti di N/OFQ hanno mostrato un profilo farmacologico simile tra i diversi trasduttori (non “biased”) e in linea con quanto osservato in set di dati precedentemente riportati. Le osservazioni effettuate in questa tesi sono di notevole importanza per approfondire la comprensione del meccanismo di attivazione del recettore NOP e, in una prospettiva futura, per sviluppare farmaci specifici per i vari trasduttori.