Validazione e applicazione di una metodica di RT-PCR per la ricerca del ceppo IB80 del virus della bronchite infettiva aviare

Avian infectious bronchitis (BI) is a highly contagious viral disease that causes respiratory, renal, and reproductive problems in chickens of all ages and production categories. The etiologic agent responsible for the disease, known as infectious bronchitis virus (IBV), is a gammacoronavirus with a single-stranded RNA genome. IBV has a high mutation rate, which, combined with frequent recombination events, has led to the emergence of several genetic subtypes. Among the most recently emerged subtypes is the second lineage of the GVIII genotype (GVIII-2), whose best-known exponent, IB80, was first identified in Germany in 2015 and subsequently in several other European countries. IB80 has been detected almost exclusively in laying and breeding hens, and appears to be associated with major declines in oviposition. In addition to their clinical impact, IB80-like strains also cause problems diagnostically, as they require specific methods to be detected. For the resolution of this diagnostic issue, the present thesis aimed to validate an RT-PCR method for the amplification of strains belonging to the GVIII genotype. Based on IB80-like sequences available in public databases, several primer pairs were designed and tested with different thermal protocols. Once the best-performing protocol was defined, a formal validation step involving the evaluation of analytical sensitivity, specificity, and repeatability was carried out. The protocol thus validated was then used to test retrospective samples from breeding and laying flocks in European countries where the circulation of IB80-like strains was already known and others where it had never been reported. This thesis thus enriched the diagnostic possibilities with respect to IBV by making available a method for detecting the GVIII genotype hitherto unavailable except in the form of a commercial kit, and by gathering useful information on the epidemiology of IB80 in European countries.

La bronchite infettiva aviare (BI) è una patologia virale altamente contagiosa che causa problematiche respiratorie, renali e riproduttive in polli di tutte le età e categorie produttive. L’agente eziologico responsabile della patologia, noto come virus della bronchite infettiva (IBV), è un gammacoronavirus con genoma a RNA a singolo filamento. IBV presenta un elevato tasso di mutazione, il quale, unito a frequenti eventi di ricombinazione, ha portato all’emergere di diversi sottotipi genetici. Tra i sottotipi emersi più di recente si annovera il secondo lignaggio del genotipo GVIII (GVIII-2), il cui esponente più noto, IB80, è stato identificato per la prima volta in Germania nel 2015 e successivamente in diversi altri paesi europei. IB80 è stato rilevato quasi esclusivamente in galline ovaiole e riproduttori, e sembra essere associato a importanti cali dell’ovodeposizione. Oltre all’impatto clinico, i ceppi IB80-like causano problemi anche dal punto di vista diagnostico, in quanto richiedono metodiche specifiche per essere rilevati. Per la risoluzione di questa problematica diagnostica, la presente tesi ha avuto come obbiettivo la validazione di una metodica di RT-PCR per l’amplificazione dei ceppi appartenenti al genotipo GVIII. Basandosi sulle sequenze IB80-like disponibili in database pubblici, sono state disegnate diverse coppie di primer, le quali sono state testate con diversi protocolli termici. Una volta definito il protocollo più prestazionale si è proceduto con una fase di validazione formale che ha previsto la valutazione di sensibilità analitica, specificità e ripetibilità. Il protocollo così validato è stato poi utilizzato per testare campioni retrospettivi provenienti da allevamenti di riproduttori e ovaiole di paesi Europei in cui la circolazione di ceppi IB80-like era già nota ed altri in cui non era mai stata segnalata. Questa tesi ha quindi permesso di arricchire le possibilità diagnostiche nei confronti di IBV, mettendo a disposizione una metodica per la rilevazione del genotipo GVIII sinora non disponibile se non in forma di kit commerciale, e di raccogliere informazioni utili sull’epidemiologia di IB80 nei paesi Europei.