Applicazione della tecnica NGS per la caratterizzazione del microbiota di bresaola durante il processo produttivo

Bresaola della Valtellina is the result of the processing method enshrined in the Production Regulations. The finished product is affected by the influence of the processing environments, which can exert a selection on the typical microbiota, which can vary depending on the characteristics of raw materials, environmental and ecological conditions, processing and aging. The subject of this thesis work is the study of the surface microbiota of 48 samples, from 3 different factories, representative of the processing method. Accurate identification of this microbiota is carried out by Ion Torrent's Next Generation Sequencing S5 molecular technology, sequencing specific DNA regions contained within the 16S gene. This is done starting with the extraction of total DNA from the samples; followed by manual steps of amplicon preparation, preparation and determination of library concentration; and finally by taking advantage of Ion Torrent's automated Ion Chef system, clonal amplification and loading of chips for insertion into the next instrument is performed. The last step involves sequencing, of the libraries loaded onto the chips, by means of the Ion S5 instrument. The data obtained are reprocessed using Excel software, and graphical displays of relative percent abundances for each sample are made. Alpha and Beta-diversity indices were also evaluated in order to understand what the diversity was within and among individual samples. The results obtained highlighted how, even starting from different raw materials and with a highly varied characteristic microbiota, the production process is able to bring about a homogenization of microbial diversity.

La Bresaola della Valtellina è il risultato del metodo di lavorazione sancito dal Disciplinare di produzione. Il prodotto finito risente dell’influenza degli ambienti di lavorazione che possono esercitare una selezione sul microbiota tipico, che può variare a seconda delle caratteristiche delle materie prime, delle condizioni ambientali ed ecologiche, della lavorazione e della stagionatura. Oggetto del presente lavoro di tesi è lo studio del microbiota superficiale di 48 campioni, provenienti da bresaole di 3 diversi stabilimenti, rappresentativi del metodo di lavorazione. L’identificazione accurata di tale microbiota viene effettuata tramite la tecnologia molecolare di Next Generation Sequencing S5 di Ion Torrent, sequenziando specifiche regioni di DNA contenute all’interno del gene 16S. Il tutto viene svolto a partire dall’estrazione del DNA totale dei campioni; a seguire vengono realizzati manualmente i passaggi di preparazione degli ampliconi, di preparazione e determinazione della concentrazione della libreria; infine sfruttando il sistema automatizzato Ion Chef di Ion Torrent viene realizzata un’amplificazione clonale e il caricamento dei chip da inserire nello strumento successivo. L’ultimo passaggio prevede il sequenziamento delle librerie caricate sui chip, per mezzo dello strumento Ion S5. I dati ottenuti vengono rielaborati con il software Excel e vengono realizzate le visualizzazioni grafiche relative alle abbondanze relative percentuali per ogni campione. Sono stati valutati, inoltre, gli indici di Alpha e Beta-diversity al fine di comprendere quale fosse la diversità all’interno dei singoli campioni e tra i campioni stessi. I risultati ottenuti hanno messo in luce come, anche partendo da materie prime differenti e con un microbiota caratteristico molto variegato, il processo produttivo sia in grado di portare ad una omogenizzazione della diversità microbica.