Nuovo modello cellulare murino per studi molecolari in vitro sulla retinite pigmentosa

Retinitis pigmentosa (RP) is an inherited form of retinal degeneration characterized by primary rod photoreceptor cell death followed by cone loss. Mutations in several genes linked to the disease cause increased levels of cyclic guanosine monophosphate (cGMP) and calcium ion influxes. The purpose of this project was to develop a new in vitro photoreceptor degeneration model for molecular studies of RP. 661W cells were genetically modified to stably express the neural retina leucine zipper (NRL) transcription factor. One clone (661W-A11) was selected based on the expression of Nrl target genes. 661W-A11 showed a significant increase in expression of rod-specific genes but not of cone-specific genes, compared with 661W cells. Zaprinast was used to inhibit phosphodiesterase 6 (PDE6) activity to mimic photoreceptor degeneration in vitro. The activation of cell death pathways resulting from PDE6 inhibition was confirmed by detection of decreased viability and increased intracellular cGMP and calcium, as well as activation of protein kinase G (PKG) and calpains. In this new in vitro system, we validated the effects of previously published neuroprotective drugs. The 661W-A11 cells may serve as a new model for molecular studies of RP and for high-throughput drug screening.

La retinite pigmentosa (RP) è una forma ereditaria di degenerazione retinica caratterizzata dalla morte dei bastoncelli seguita dalla perdita dei coni. Le mutazioni in diversi geni legati alla malattia causano un aumento dei livelli di guanosin-monofosfato ciclico (cGMP) e del flusso di ioni calcio. Lo scopo di questo progetto è quello sviluppare un nuovo modello di degenerazione dei fotorecettori in vitro per studi molecolari sulla RP. Le cellule 661W sono state geneticamente modificate per esprimere stabilmente il fattore di trascrizione della proteina zip leucina specifica per la retina neurale (NRL). Un clone (661W-A11) è stato selezionato in base all'espressione dei geni bersaglio Nrl. 661W-A11 ha mostrato un aumento significativo nell'espressione di geni specifici dei bastoncelli ma non di geni specifici dei coni, rispetto alle cellule 661W. Zaprinast è stato utilizzato per inibire l'attività della fosfodiesterasi 6 (PDE6) per simulare la degenerazione dei fotorecettori in vitro. L'attivazione dei pathway di morte cellulare derivanti dall'inibizione della PDE6 è stata confermata dal rilevamento di una ridotta vitalità e di un aumento di cGMP e calcio intracellulari, così come dall'attivazione della proteina chinasi G (PKG) e delle calpaine. In questo nuovo sistema in vitro, sono stati convalidati gli effetti dei farmaci neuroprotettivi precedentemente pubblicati. Le cellule 661W-A11 potrebbero servire come nuovo modello per gli studi molecolari sulla RP e per lo screening farmacologico ad alto rendimento.