Studio genetico dei fattori della coagulazione nelle malattie emorragiche e trombotiche congenite

Introduzione: Le malattie emorragiche e trombotiche congenite (METC) sono un gruppo di patologie causate da disfunzione di uno o più fattori della coagulazione o del numero e della funzione delle piastrine, con conseguenze fenotipiche che variano dalla tendenza al sanguinamento spontaneo alla trombosi venosa profonda o arteriosa. Le METC comprendono difetti coagulativi rari dei fattori della coagulazione, le emofilie, la malattia di Von Willebrand, e degli enzimi che regolano la fibrinolisi. In questi anni, l’analisi molecolare e genetica sulle malattie METC ha avuto un forte impulso nell’ambito scientifico, diagnostico e terapeutico soprattutto grazie allo sviluppo di piattaforme di sequenziamento di nuova generazione, Next Generation Sequencing (NGS). Scopo di questo lavoro è stato quello di a. portare alla validazione di un pannello genetico di sequenziamento con tecnologia NGS in pazienti affetti da METC; b. l’analisi in silico delle varianti genetiche identificate al fine di predirne il ruolo biologico e la relazione con il trattamento farmacologico. Pazienti e Metodi: Sono stati reclutati 103 pazienti affetti da METC seguiti presso il Centro delle Malattie Trombotiche ed Emorragiche dell’Azienda Ospedaliera Universitaria di Padova. Per ogni partecipante è stato raccolto un campione di sangue venoso per l’estrazione del DNA. Le librerie per il sequenziamento NGS sono state preparate mediante frammentazione del DNA, ligazione degli adattatori, arricchimento e cattura dei frammenti degli acidi nucleici mediante specifiche sonde studiate per un pannello di geni target selezionati. Il pannello genico è costituito da 861 sonde che coprono la porzione esonica e border intronico-esonico di 33 geni. Il sequenziamento NGS è stato eseguito mediante la piattaforma NextSeq-550 e l’analisi bioinformatica delle sequenze nucleotidiche mediante pipelines e workflows specifici per l’identificazione di mutazioni germinali. Le mutazioni missenso sono state analizzate in silico mediante specifici softwares per prevedere la patogenicità delle varianti genetiche individuate. Risultati: Sono state identificate mutazioni missenso note, potenzialmente patologiche in circa il 73% dei pazienti affetti da METC. In alcuni soggetti sono state identificate delle mutazioni non note come la mutazione c.1621C>T del gene F2 con sostituzione amminoacidica p.Arg541Trp, la mutazione c.1303G>A del gene F2 con sostituzione amminoacidica p. Glu435Lys e la mutazione c.1368T>C del gene PLAT (Attivatore del plasminogeno coinvolto nella via della fibrinolisi) con sostituzione amminoacidica p.Leu287Pro. Ulteriori considerazioni sono emerse dai risultati ottenuti dallo screening genetico in relazione alla terapia farmacologica. Conclusione: I risultati ottenuti dimostrano che la tecnologia di sequenziamento NGS rappresenta una valida strategia per l’analisi delle varianti genetiche presenti nelle forme rare delle malattie emorragiche e trombotiche e contribuiscono a consolidare la conoscenza relativa alle basi genetiche di tale patologia. Inoltre, lo studio del ruolo fisiopatologico di queste mutazioni potrà fornire utili informazioni per lo sviluppo di efficaci terapie farmacologiche.