Determinazione e Sfida di parametri critici nel processo di produzione di proteine ricombinanti.

Background: Biopharmaceutical production has rapidly increased over the past years. Many companies like Philogen S.p.A (from now “Philogen”) are investing time and money in developing fast, effective, GMP driven processes in order to treat patients with high-quality products. Unlike small molecules, these drugs are very large and complex, produced by cells or bacteria. For this reason, they require a specific manufacturing process, which can be divided in two macro phases called Upstream and Downstream. Upstream A is characterized by the cell expansion phases, starting from a cryotube, necessary to obtain the cell density to enable the inoculum of bioreactors and the starting of the Upstream B, so the fermentation phase, where the protein is produced. In Downstream A there is the capture step of the protein of interest through affinity chromatography, while in Downstream B intermediate and final polishing steps, through respectively CIEX and AIEX, are conducted, together with buffer exchange to suspend the protein in physiological (formulation) buffers and the filling at the desired concentration. The ex-novo process development and the study of pre-existing processes are conducted by the Optimization department inside the company itself, where the critical points of a process are determined and studied according to various approaches. Ensuring consistent high yields and product quality are key challenges in biomanufacturing. Even minor deviations in process parameters can significantly affect product critical quality attributes (CQAs), such as glycosylation and aggregation, and process performance. In this work the Critical Process Parameters of the manufacturing process of an immunocytokine produced by Philogen are determined and challenged, and their relationship with CQAs are discussed, in particular focusing on bioreactor stirring rate for what concerns upstream, while regarding downstream affinity chromatography and CIEX are considered. Results: The outcome of the parameter challenging led to the identification of Critical Process Parameters (CPPs) as well as Key Process Parameters (KPPs). In upstream the increased stirring rate resulted in a reduction of cell growth and viability that was reflected in a decreased productivity level, but no CQA was affected, thus addressing this parameter as a KPP. In downstream, the increased affinity chromatography loading input led to an increased amount of HCP content, so it can be defined as a CPP. In CIEX finally, both increased loading pH and conductivity values resulted in a loss of material during the run, leading to a clear reduction of yield. In the first case the change of pH directly affects protein CQAs, while in the second case only the performance is affected, thus they were addressed respectively as CPP and KPP. Conclusions: Risk assessment is a precious tool that companies like Philogen use for bioprocess definition and characterization. The identification of CQAs and related CPPs is fundamental to set the best control strategy to correctly allow the commercial production of the intended quality recombinant proteins. This work is a clear example of how the upstream and downstream steps can be divided and how the different parameters alterations, even if small, can influence the overall efficacy of the process.

Background: La produzione di biofarmaci è aumentata rapidamente negli ultimi anni. Molte aziende, come Philogen S.p.A. (d'ora in poi "Philogen"), stanno investendo tempo e denaro nello sviluppo di processi GMP rapidi ed efficaci, al fine di trattare i pazienti con prodotti di alta qualità. A differenza delle piccole molecole, questi farmaci sono molto più complessi, e vengono prodotti da cellule o batteri. Per questo motivo, richiedono un processo di produzione specifico, che può essere suddiviso in due macro-fasi chiamate Upstream e Downstream. L'Upstream A è caratterizzato dalle fasi di espansione cellulare, a partire da un criotubo, necessarie per ottenere la densità cellulare tale da consentire l'inoculo nei bioreattori e l'avvio dell’Upstream B, quindi la fase di fermentazione, dove viene prodotta la proteina di interesse. Nel Downstream A avviene la fase di cattura della proteina di interesse tramite cromatografia per affinità, mentre nel Downstream B vengono condotte le fasi di purificazione intermedia e finale, rispettivamente tramite CIEX e AIEX, insieme allo scambio di tamponi per sospendere la proteina in tamponi fisiologici (di formulazione) ed infialamento alla concentrazione desiderata. Lo sviluppo di processi ex-novo e lo studio di processi preesistenti sono condotti dal dipartimento di Ottimizzazione all'interno dell'azienda stessa, dove i punti critici di un processo sono determinati e studiati secondo vari approcci. Garantire rendimenti elevati e qualità costante del prodotto sono sfide fondamentali nella produzione di biofarmaci. Anche piccole deviazioni nei parametri di processo possono influenzare significativamente sia i cosiddetti Critical Quality Attributes (CQA) del prodotto, come la glicosilazione e l'aggregazione, sia le prestazioni del processo stesso. In questo lavoro vengono determinati e sfidati i parametri critici del processo di produzione di un'immunocitochina prodotta da Philogen e viene discussa la loro relazione con i CQA, in particolare concentrandosi sulla velocità di agitazione del bioreattore per quanto riguarda l'upstream, mentre per quanto riguarda il downstream vengono presi in considerazione la cromatografia per affinità e la CIEX. Risultati: Il risultato del confronto dei parametri ha portato all'identificazione di parametri critici di processo (CPP) e parametri chiave di processo (KPP). Nella fase upstream, l'aumento della velocità di agitazione ha comportato una riduzione della crescita e della vitalità delle cellule, che si è riflessa in una diminuzione del livello di produttività, ma i CQAs non sono stati influenzati, per cui questo parametro è stato considerato un KPP. Nella fase downstream, l'aumento del carico della cromatografia per affinità ha portato a un aumento del contenuto di HCP, quindi può essere definito come un CPP. In CIEX, infine, sia l'aumento del pH di carico che i valori di conducibilità hanno comportato una perdita di materiale durante la corsa, con conseguente riduzione netta della resa. Nel primo caso, la variazione del pH influisce direttamente sui CQA, mentre nel secondo caso viene influenzato solo il rendimento; quindi, sono stati quindi etichettati rispettivamente come CPP e KPP. Conclusioni: La valutazione del rischio è uno strumento prezioso che aziende come Philogen utilizzano per la definizione e la caratterizzazione dei bioprocessi. L'identificazione dei CQA e dei relativi CPP è fondamentale per impostare la migliore strategia di controllo che consenta di produrre correttamente le proteine ricombinanti della qualità desiderata. Questo lavoro è un chiaro esempio di come le fasi upstream e downstream possano essere scomposte e di come le alterazioni dei diversi parametri, anche se piccole, possano influenzare l'efficacia complessiva del processo.