Genesi di un modello cellulare mediante CRISPR-Cas9 per lo studio del ruolo di un gene candidato nella predisposizione all’iperplasia surrenalica macronodulare bilaterale primaria (PBMAH)

La PBMAH (Primary bilateral macronodular adrenocortical hyperplasia) è una rara iperplasia delle ghiandole surrenaliche. È una delle cause di iperproduzione di cortisolo endogena, associata alla sindrome di Cushing. Si presenta in forma sporadica, ereditaria, oppure può concorrere nella manifestazione di sindromi tumorali. La patogenesi della malattia nella forma ereditaria non è ancora nota: ad oggi, mutazioni germinali in ARMC5 e KDM1A sono state identificate come causative. Nel laboratorio di Genetica Molecolare Umana, dall’analisi di una famiglia con ricorrenza di PBMAH a patogenesi sconosciuta è stata identificata una variante nonsenso del gene EFCAB2. In questa tesi, si è utilizzato un approccio di CRISPR-Cas9 sulla linea Nthy-ori 3-1 per generare cellule knockout per il gene EFCAB2 a caratterizzarne l’effetto funzionale. Dopo la selezione cellulare, sono stati ottenuti cloni eterozigoti su cui si sono eseguiti il saggio MTT, monitoraggio con Incucyte® e colony formation assay per verificare gli effetti della ridotta espressione di EFCAB2 nel contesto cellulare. Per il saggio MTT, sono stati ottenuti risultati significativi in riferimento ad un clone. Inoltre, è stato analizzato il pathway del cortisolo su un clone eterozigote ottenuto dall’editing genetico della linea cellulare cortisolo-secernente NCI-H295R, rilevando un trend di aumento dell’espressione di tre geni rispetto ai controlli.