Effetto di derivati del 2-(fenilammino)-7,8-diidrochinazolin-5(6H)-one sulle chinasi GSK3β e DYRK1A, per il trattamento multi-target di malattie neurodegenerative

Introduzione. Negli organismi eucarioti, la fosforilazione delle proteine rappresenta una delle più comuni e importanti modifiche post-traduzionali. Essa è implicata in numerose vie di trasduzione del segnale all’interno della cellula che regolano il metabolismo, la proliferazione cellulare, l’apoptosi e la regolazione dell'espressione genica. Questa reazione è catalizzata dalle protein chinasi, una famiglia di enzimi che agisce trasferendo il gruppo fosfato terminale dell'ATP ad uno specifico residuo di Ser, Thr o Tyr sui substrati proteici. La deregolazione di specifiche chinasi è stata riscontrata in molteplici patologie, tra cui le malattie neurodegenerative di Alzheimer e Parkinson, in aggiunta all’aumentata espressione della MAO-B che genera un maggior stress ossidativo. La sovraespressione delle protein chinasi GSK3β e DYRK1A è stata riconosciuta come un importante fattore che contribuisce, ad esempio, all'iperfosforilazione della proteina Tau, il cui accumulo costituisce il principale segno distintivo neuropatologico della malattia di Alzheimer. Dato l’importante ruolo che rivestono in queste patologie, le protein chinasi stanno diventando dei bersagli farmacologici. Scopo. L’obbiettivo di questo lavoro è quello di individuare, all’interno di una serie di molecole derivati del 2-(fenilammino)-7,8-diidrochinazolin-5(6H)-one che hanno dimostrato una significativa attività inibitoria delle monoammino ossidasi (MAO), con una maggior affinità o specificità per MAO-B, possibili inibitori di GSK3β e DYRK1A nell’ottica di ottenere una terapia multi-target per contrastare la patogenesi delle malattie neurodegenerative. Materiali e metodi. Il saggio di attività enzimatica, in presenza di questi composti, viene eseguito in vitro, tramite l’utilizzo di [γ33 P] ATP, sulle chinasi DYRK1A e GSK3β, in presenza dei rispettivi substrati quali l’istone H3 ed un peptide specifico per DYRK1A, e un peptide specifico per GSK3β. L’attività chinasica di questi enzimi è stata quantificata attraverso due strumenti in grado di captare la radioattività: Cyclone Plus Storage Phosphor System e Tricab liquid scintillation counter. Sono stati eseguiti dei saggi di cinetica enzimatica su GSK3β per individuare il tipo di inibizione. I valori ottenuti sono stati analizzati e graficati attraverso il software GraphPad Prism. L’effetto inibitorio di uno di questi composti è stato studiato anche su una linea cellulare di neuroblastoma umano, chiamata SH-SY5Y, eseguendo dei trattamenti a diverse concentrazioni. I lisati cellulari sono stati analizzati procedendo con la separazione delle proteine attraverso la tecnica elettroforetica SDS-PAGE, per andare ad individuare tramite western-blotting eventuali differenze nella iperfosforilazione della proteina tau. Risultati. Dai saggi di attività è stato osservato che questi composti non risultano avere un effetto inibitorio sull’attività di DYRK1A. Ciò nonostante, un analogo del 2-(fenilammino)-7,8-diidrochinazolin-5(6H)-one risulta attivo nei confronti di GSK3β. Dalle curve di cinetica, non è possibile definire con chiarezza il meccanismo inibitorio. A livello cellulare non sono state riscontrate differenze significative nella iperfosforilazione di tau, si è tuttavia osservato un calo della Tau totale. Conclusioni. I risultati ottenuti dimostrano che un analogo del 2-(fenilammino)-7,8-diidrochinazolin-5(6H)-one, avente come sostituenti due atomi di cloro in posizione meta e para dell’anello benzenico, presenta una blanda efficacia inibitoria nei confronti di GSK3β. Pertanto può essere utilizzato come molecola di partenza per ottenere dei composti multi-target che risultino attivi su GSK3β senza perdere la capacità inibitoria su MAO, in particolare su MAO-B. La riduzione a livello cellulare della Tau dimostra che questa molecola, e suoi possibili, debbano essere analizzati nella loro capacità di ridurre e/o prevenire il danno sinaptico.