Studi preformulativi di nanoparticelle ANANAS (Avidin-Nucleic-Acid-NanoASsembly) per il delivery di acidi nucleici

Negli ultimi anni, farmaci a base di oligonucleotidi terapeutici, sono sempre più utilizzati e studiati nelle terapie innovative. Gli oligonucleotidi più utilizzati per queste formulazioni sono siRNA (piccola RNA interferenti), miRNA (microRNA) e ASO (oligonucleotidi antisenso); tali molecole sono in grado di modulare l’espressione di determinate proteine regolando la trascrizione o la traduzione dei relativi mRNA. Le principali problematiche nell’utilizzo di tali biomolecole sono: (I) la loro breve emivita dovuta alla presenza di numerosi enzimi catalitici nel flusso sanguigno; (II) il delivery sito specifico; (III) la via di somministrazione. Per risolvere queste problematiche vengono spesso utilizzate nanoparticelle di vario genere come nanoparticelle d’oro o complessi polimerici che sono in grado di veicolare, proteggere e direzionare gli acidi nucleici terapeutici al sito target. Nel caso di questa tesi sono state utilizzate le nanoparticelle ANANAS (Avidin-Nucleic-Acid-NanoASsemblies). Una caratteristica particolare di queste nanoparticelle è la loro capacità di sfruttare il legame avidina-biotina (Kd 10-15 M) per potervi legare in maniera stechiometricamente ben definita qualsiasi molecola purché precedentemente biotinilati. Se decorate con agenti direzionanti, le ANANAS possono essere direzionate al sito target e internalizzate per endocitosi recettore mediata; per loro natura sono inoltre in grado di raggiungere il comparto endo/lisosomiale e, grazie alla coniugazione con molecole fusogeniche, sono in grado di essere liberate nel citoplasma con conseguente rilascio del farmaco. Le nanoparticelle ANANAS, per via di queste caratteristiche, risultano essere un nanocarrier promettente per veicolare siRNA e miRNA a livello cellulare, sito specifico, prevenendone la degradazione. La presenza di un agente fusogenico risulta essere fondamentale in queste formulazioni in quanto permette la fuoriuscita delle nanoparticelle dagli endo-lisosomi e il conseguente rilascio dell’oligonucleotide Lo scopo di questa tesi è condurre studi preformulativi per la generazione di nanoassemblati ANANAS multifunzionali con miRNA, elementi direzionanti verso cellule target ed elementi fusogenici. In una prima fase è stato messo a punto un protocollo analitico via elettroforesi in gel di poliacrilammide che ha consentito di visualizzare e quantificare gli oligonucleotidi di interesse (miRNA, siRNA): la metodica ottimizzata è in grado di distinguere gli oligonucleotidi da eventuali loro prodotti di degradazione e di differenziare quando essi sono liberi o assemblati alle nanoparticelle. Grazie a questo protocollo, associato ad indagini cromatografiche in gel filtrazione, sono stati condotti studi preformulativi, nei quali si è studiata e quantificata la caricabilità degli oligonucleotidi biotinilati sulle nanoparticelle ANANAS in funzione di diverse variabili composizionali e di processo; in particolare a) il pH di assembly, b) la natura dello spaziatore tra la biotina e l’oligonucloetide, c) il grado di PEGilazione del core nanoparticellare, d) la co-presenza di altre funzionalità biotinilate (-direzionante e fusogenica-) e) l’ordine di aggiunta dei diversi componenti biotinilati. Tali studi hanno portato all’ottimizzazione di una composizione contenente tutti gli elementi funzionali teoricamente necessari per l’ottenimento di un sistema di delivery direzionato verso cellule target. Studi di dynamic light scattering hanno dimostrato che essa è colloidalmente stabile e ulteriori indagini hanno dimostrato che l’uso dello spaziatore disolfuro tra la biotina e miRNA consente il rilascio dell’oligonucleotide una volta che l’assembly si viene a trovare in condizioni riducenti quali quelle del citoplasma. Le prospettive future di questo studio sono quindi test di efficacia e di modulazione delle funzioni biologiche regolate dal miRNA 206.