Identificazione di benzodiazepine in campioni biologici mediante determinazione del loro profilo metabolico esaustivo per mezzo di analisi LC-HRAM-Orbitrap-MS.

LC-HRAM-Orbitrap-MS (Liquid Chromatography - High-Resolution Accurate-Mass - Orbitrap - Mass Spectrometry) is an analytical technique that allows the mass spectrometric measurement of chemical compounds with very high analytical sensitivity and specificity. It enables the identification of both active substances of pharmacological-toxicological interest and their numerous phase I and II metabolites in a wide variety of biological matrices, even in the absence of analytical reference standards, and simplifies sample preparation procedures with a relative reduction in time and cost. The thesis describes the application of LC-HRAM-Orbitrap-MS for the development of a tool to identify comprehensive metabolite profiles of benzodiazepine compounds of high prevalence and clinical and forensic toxicological interest, potentially present in various biological samples. The study first consisted of an extensive review of the scientific literature and consultation of online databases to identify possible phase I and II metabolites of the selected benzodiazepines. Subsequently, at the Clinical and Forensic Toxicology Laboratory of the Azienda ULSS 3 Serenissima, many whole blood, urine and vitreous samples from subjects who had already tested positive for the use of one or more benzodiazepines were analysed to experimentally verify the different metabolic profiles identified in the literature review. Samples were prepared from 100 mcL of the different biological matrices by simple and rapid deproteinisation with a 2:1 mixture of acetonitrile:methanol, in the presence of the internal standard Nordiazepam-D5. The extracts obtained were subjected to LC-HRAM-Orbitrap-MS analysis using a Thermo Scientific Ultimate 3000 UHPLC system equipped with an Accucore Phenyl Hexyl reversed-phase analytical column coupled to a Thermo Scientific “Q-Exactive Focus" Orbitrap mass spectrometer instrument. For each of the approximately 100 analytes of interest (benzodiazepines and their numerous phase I and II metabolites), the following were determined: chromatographic retention time; exact mass of the quasi-molecular ionic species (MH+); experimental and calculated isotopic patterns of the MH+ ionic species; and fragmentation patterns under HRAM-MS conditions of the MH+ ionic species. The data set obtained made it possible to define, for each of the benzodiazepines considered, exhaustive and characteristic metabolic profiles, the application of which allows to prove unequivocally that the subjects providing the biosamples had consumed specific benzodiazepine compounds.

La tecnica analitica LC-HRAM-Orbitrap-MS (Liquid Chromatography – High-Resolution Accurate-Mass – Orbitrap – Mass Spectrometry) consente di effettuare misure spettrometriche di massa di composti chimici con elevatissime sensibilità analitica e specificità identificativa. In particolare, permette l'identificazione in svariate matrici biologiche sia di principi attivi di interesse farmaco-tossicologico che dei loro numerosi metaboliti di fase I e II, anche in assenza standard analitici di riferimento, consentendo inoltre la semplificazione, con relativa riduzione di tempi e costi, delle procedure di preparazione dei campioni. La tesi descrive l’applicazione della LC-HRAM-Orbitrap-MS per la messa a punto di un sistema identificativo, in diversi campioni biologici, di profili metabolici esaustivi di composti benzodiazepinici a maggiore diffusione ed interesse tossicologico clinico e forense. La sperimentazione è consistita, dapprima, nell’estensiva revisione della letteratura scientifica e consultazione di banche dati online con finalità identificative dei possibili metaboliti di fase I e di fase II delle benzodiazepine selezionate. Successivamente, sono stati analizzati numerosi campioni di sangue intero, urina, e umor vitreo di soggetti già risultati positivi per l’assunzione di una o più benzodiazepine presso il Laboratorio di Tossicologia Clinica e Forense dell’Azienda ULSS 3 Serenissima, per la verifica sperimentale dei diversi profili metabolici individuati nella revisione di letteratura. La preparazione del campione è stata ottenuta, a partire da 100 mcL delle diverse matrici biologiche, mediante semplice e veloce deproteinizzazione con miscela acetonitrile:metanolo 2:1, in presenza dello standard interno Nordiazepam-D5. Gli estratti ottenuti sono stati sottoposti ad analisi LC-HRAM-Orbitrap-MS utilizzando un sistema UHPLC Thermo Scientific Ultimate 3000, dotato di colonna analitica a fase inversa Accucore Phenyl Hexyl, accoppiato allo strumento Thermo Scientific “Q-Exactive Focus” Orbitrap Mass Spectrometer. Per ognuno dei circa 100 analiti di interesse (benzodiazepine e loro numerosi metaboliti di fase I e II) sono stati determinati: tempo di ritenzione cromatografico; massa esatta delle specie ioniche quasi-molecolari (MH+); pattern isotopici sperimentali e calcolati delle specie ioniche MH+; pattern di frammentazione in condizioni HRAM-MS delle specie ioniche MH+. L’insieme dei dati ottenuti ha consentito, per ognuna delle benzodiazepine considerate, di allestire profili metabolici esaustivi e caratteristici, la cui applicazione permette di dimostrare incontrovertibilmente l’avvenuta assunzione, da parte dei soggetti fornitori dei campioni biologici, di specifici principi attivi benzodiazepinici.