Sintesi e caratterizzazione del coniugato FTY720-biotina per l’utilizzo in formulazioni di NP ANANAS fusogeniche

Le particelle nanometriche ANANAS (Avidin-Nucleic Acid NanoASsemblies) costituiscono una categoria di nanoparticelle composte da unità di avidina che condensando intorno a un filamento circolare di DNA, formando una struttura toroidale delle dimensioni di un centinaio di nanometri. Questi nanosistemi sono stabilizzati in soluzioni acquose grazie a uno strato esterno di PEG. La formulazione delle nanoparticelle sfrutta l'alta affinità dell'avidina per gli acidi nucleici, consentendo di ottenere una composizione ben definita. Data la natura biocompatibile e biodegradabile dei componenti, le NP ANANAS possono essere utilizzate sia in vitro che in vivo come carrier specifici per farmaci. Le nanoparticelle possono essere funzionalizzate con diverse tipologie di sonde e farmaci con un preciso controllo stechiometrico, a condizione che siano stati precedentemente biotinilati. Infatti, per la funzionalizzazione di questi nanosistemi, viene sfruttata l'alta affinità tra la biotina e l'avidina (Kd = 10-15 M). Le ANANAS possono essere funzionalizzate con elementi direzionanti, come ad esempio anticorpi monoclonali biotinilati, consentendone l’interazione con le linee cellulari che presentano i recettori target. A seguito di questa interazione, le nanoparticelle vengono internalizzate attraverso il processo di endocitosi mediato dai recettori e raggiungono il compartimento endo/lisosomiale. Questo meccanismo permette l'impiego delle ANANAS per il trasporto di molecole attive idrofobiche e resistenti all'ambiente lisosomiale. Tuttavia, le ANANAS non permettono il rilascio del farmaco nel citoplasma. Le vescicole, quindi, andrebbero naturalmente indirizzate alla fusione con i lisosomi nel normale processo di catabolismo cellulare. Ma poiché il pathway lisosomiale porterebbe a processi di degradazione all’interno delle vescicole, ad esempio, gli acidi nucleici come miRNA e siRNA verrebbero idrolizzati rapidamente. Pertanto, per preservare l’attività di questi agenti terapeutici, è necessario introdurre un sistema di veicolazione che protegga le molecole nell'ambiente endo/lisosomiale e consenta successivamente la loro liberazione nel citoplasma. Questo progetto di tesi mira all’individuazione, sintesi e caratterizzazione di un composto che consenta l’escaping lisosomiale delle nanoparticelle permettendo il rilascio del farmaco/cargo, trasportato dalla NP, nel citoplasma. A tale scopo entra in gioco FTY720. Questa molecola è il primo farmaco approvato dall’FDA nel 2010 per il trattamento orale della a sclerosi multipla (SM) recidivante-remittente altamente attiva. Oltre all’attività immunomodulatoria diversi studi indagano le potenziali attività del composto come agente fusogenico. Questa molecola è infatti un analogo strutturale della sfingosina, che si ipotizza essere in grado di interagire con le proteine SNARE e i fosfolipidi di membrana destabilizzando le vescicole endosomiali e promuovendo la destabilizzazione ed il riversamento della vescicola stessa con il conseguente rilascio del cargo nel citoplasma. Lo scopo di questa tesi è stato lo sviluppo di un nuovo elemento fusogenico biotinilato basato su FTY720 attraverso la sintesi, caratterizzazione, gli studi di caricamento e stabilità delle nanoparticelle ANANAS funzionalizzate con tale composto ed infine i primi studi di efficacia in vitro.