Produzione della proteina anti-apoptotica umana Mcl-1 e screening di frammenti a basso peso molecolare tramite Risonanza Magnetica Nucleare

Bcl-2 proteins, classified as antiapoptotic proteins, play a crucial role in regulating cell death homeostasis. Among them, hMcl-1 stands out, exhibiting overexpression in both liquid and solid tumors. This overexpression not only promotes disease progression but also amplifies resistance mechanisms against conventional tumor drugs, rendering established therapies ineffective. In this research, Fragment-Based Drug Discovery (FBDD) was employed using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy. This innovative approach involves the examination of interactions between small molecules, referred to as Ultra-Low Molecular Weight (ULMW) fragments, and the Protein Of Interest (POI). ULMW fragments, being exceptionally small molecules, possess the unique ability to bind to multiple sites on the protein surface, including those that are traditionally challenging to access. The FBDD technique employing ULMW fragments is pioneering with minimal published coverage, marking a significant advancement in the field. So far, only one study has used this type of molecules to perform FBDD, and this was done through the use of X-Ray Crystallography. Therefore, the novelty introduced by this thesis lies in exploring the feasibility of performing a similar analysis by NMR and establishing a comprehensive methodology for data analysis. The production of hMcl-1 followed a newly developed protocol, and the FBDD by NMR technique was applied through the examination of Chemical Shift Perturbation (CSP).

Le proteine Bcl-2, classificate come proteine antiapoptotiche, svolgono un ruolo cruciale nella regolazione dell'omeostasi della morte cellulare. Tra queste, spicca hMcl-1, che mostra una sovraespressione sia nei tumori liquidi che in quelli solidi. Questa sovraespressione non solo promuove la progressione della malattia, ma amplifica anche i meccanismi di resistenza ai farmaci tumorali convenzionali, rendendo inefficaci le terapie consolidate. In questa ricerca è stata impiegata la Fragment-Based Drug Discovery (FBDD) utilizzando la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Questo approccio innovativo prevede l'esame delle interazioni tra piccole molecole, definite frammenti a bassissimo peso molecolare (ULMW), e la proteina di interesse (POI). I frammenti ULMW, essendo molecole eccezionalmente piccole, possiedono la capacità unica di legarsi a più siti sulla superficie delle proteine, compresi quelli tradizionalmente di difficile accesso. La tecnica FBDD che impiega i frammenti ULMW è pionieristica, con una copertura minima pubblicata, e segna un progresso significativo in questo campo. Finora, solo uno studio ha utilizzato questo tipo di molecole per eseguire la FBDD, e questo è stato fatto attraverso l'uso della cristallografia a raggi X. Pertanto, la novità introdotta da questa tesi consiste nell'esplorare la fattibilità di eseguire un'analisi simile mediante NMR e nello stabilire una metodologia completa per l'analisi dei dati. La produzione di hMcl-1 ha seguito un protocollo di nuova concezione e la tecnica FBDD mediante NMR è stata applicata attraverso l'esame della Chemical Shift Perturbation (CSP).