Sistemi di gene delivery lipidici per il silenziamento del fattore di trascrizione NFIX nella distrofia muscolare

Gene therapy represents an increasingly promising field in the biomedical and clinical context, allowing the correction of genetic defects responsible for severe pathologies through the introduction of exogenous material such as DNA or RNA. The advent of mRNA-based vaccines against SARS-CoV-2 has further boosted interest for gene therapy. One area where the innovative application of gene therapy could be very useful is represented by muscular dystrophies, a group of hereditary diseases of varying severity and symptomatology characterized by progressive muscle weakness. In this context, gene therapies address a new target, the Nfix protein, encoded by the NFIX gene located on human chromosome 19. This protein plays a crucial role as transcription factor, regulating the activation and repression of gene transcription in several organs. Studies in dystrophin-deficient transgenic mouse models have shown that silencing the NFIX factor can protect against the muscle degeneration typical of muscular dystrophies. The silencing of the NFIX factor is achieved by using a plasmid containing the gene encoding for a short hairpin RNA, whose binding to the Nfix mRNA inhibits protein translation. For gene therapy to be effective, it is essential to use a suitable delivery system, like lipid- based drug delivery systems such as lipid nanoparticles (LNPs) or cationic liposomes. These systems are highly biocompatible due to their composition analogous to biological membranes and the presence of positive charges promotes greater interaction with nucleic acids. The goal of this thesis project is to develop lipid delivery systems (Lipid nanoparticles /cationic liposomes) through microfluidic techniques capable of encapsulating and delivering the pCito_shNfix plasmid with the aim of inducing the silencing of Nfix responsible for the degenerative progression of muscular dystrophies. Formulations were produced with the ionizable lipid DLin-KC2-DMA and the cationic lipid DOTAP, associated with other components such as cholesterol (a membrane fluidity regulator), HSPC (a stabilizing neutral phospholipid), and PEG (which gives stealth properties to the formulation). All formulations were characterized morphologically (size and PDI) and in terms of zeta potential using DLS, for the encapsulation efficiency through the Picogreen assay and for plasmid quality using agarose gel. Some formulations underwent additional morphological observation through transmission electron microscopy (TEM). Throughout this project, the conditions regarding the optimal molar ratios between components, differences between the N/P ratio and pH were investigated to achieve better results in terms of in vitro transfection efficiency and minimize the percentage of damaged plasmid. The formulations produced were subsequently tested in vitro using various types of cell lines: C2C12 cells (immortalized myogenic cells capable of maintaining the muscle cell behavior), stabilized primary myogenic cells, and primary myogenic cells.

La terapia genica rappresenta una prospettiva sempre più promettente nel contesto biomedico e clinico, consentendo la correzione dei difetti genetici responsabili di gravi patologie mediante l'introduzione di materiale esogeno come DNA o RNA. L'emergere dei vaccini a base di mRNA contro il SARS-CoV-2 ha ulteriormente amplificato l'interesse e le ricerche legate alla terapia genica. Uno degli ambiti in cui l'applicazione innovativa delle terapie geniche potrebbe rivelarsi particolarmente efficace è rappresentato dalle distrofie muscolari, un insieme di patologie ereditarie di varia gravità e sintomatologia caratterizzate da progressivo indebolimento muscolare. In questo contesto, le terapie geniche mirano a un nuovo bersaglio, la proteina Nfix, codificata dal gene NFIX situato sul cromosoma 19 umano. Questa proteina svolge un ruolo cruciale come fattore di trascrizione, regolando l'attivazione e repressione della trascrizione genica in vari organi. Ricerche su modelli murini transgenici privi di distrofina hanno indicato che il silenziamento del fattore NFIX potrebbe proteggere dalla degenerazione muscolare tipica delle distrofie muscolari. Il silenziamento del fattore NFIX è ottenuto mediante l'utilizzo di un plasmide contenente il gene codificante per uno short harpin RNA, il cui legame con mRNA di Nfix inibisce la traduzione proteica. Affinché la terapia genica sia efficace, è essenziale adottare un sistema di veicolazione adeguato, come i sistemi di Drug Delivery a base lipidica come lipid nanoparticles (LNPs) o i liposomi cationici. Questi sistemi infatti sono altamente biocompatibili per via della composizione analoga a quella delle membrane biologiche, inoltre la presenza di cariche positive permette una maggiore capacità di interazione con gli acidi nucleici. L’obiettivo di questo progetto di tesi è di sviluppare attraverso tecniche di microfluidica dei sistemi di delivery lipidici (LNP/liposomi cationici) in grado di incapsulare e veicolare il plasmide pCito_shNfix con lo scopo di indurre il silenziamento di Nfix responsabile della progressione degenerativa delle distrofie muscolari. Sono state prodotte formulazioni con il lipide ionizzabile DLin-KC2-DMA e con il lipide cationico DOTAP associati ad altri componenti come il colesterolo, regolatore di fluidità delle membrane, HSPC, fosfolipide neutro dal ruolo stabilizzante e PEG in grado di conferire proprietà stealth alla formulazione. Tutte le formulazioni sono state caratterizzate dal punto di vista morfologico (dimensioni e PDI) e della carica attraverso DLS, per l’efficienza di incapsulazione tramite il saggio Picogreen e per la qualità del plasmide attraverso gel di agarosio. Per alcune formulazioni è stata eseguita anche un’ulteriore osservazione morfologica attraverso microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Nel corso del progetto sono state investigate le condizioni di rapporto molare tra le componenti, il rapporto N/P e pH capaci di dare risultati migliori in termini di efficienza di trasfezione in vitro e di ridurre il più possibile la percentuale di plasmide danneggiato. Le formulazioni prodotte sono state testate successivamente in vitro utilizzando diverse tipologie di linee cellulari: cellule C2C12 (ovvero cellule immortalizzate miogeniche capaci di mantenere il comportamento di cellula muscolare), cellule miogeniche primarie stabilizzate e cellule miogeniche primarie.