Innovative strategies for drug testing and mycotoxin cytotoxicity evaluation: the convergence of microfluidic devices and 3D culture systems

Standard in vitro experimental models have proven invaluable in advancing our knowledge of biological systems for decades, despite being affected by several limitations. With a focus on cancer research, we highlight their poor mimic of the complexity and heterogeneity of human tumors and scarce control over the microenvironment spatial-temporal composition. Technological advances in bio- and microfabrication are revolutionizing cancer research by providing tools more closely recapitulating the complex three-dimensional (3D) architecture and environment of native tumors compared to traditional two-dimensional (2D) cell cultures. The integration of 3D models with microfluidic technologies enables further control of the spatial and temporal dynamics of in vivo tumor microenvironments. We set two main goals for this proposed research: assessing the toxicological risks of mycotoxins and conducting drug tests on human cancer models. To this aim, we will design, produce, and validate two microfluidic platforms. The first is dedicated to investigating cytotoxicity induced by mycotoxins, while the second focuses on assessing cytotoxicity induced by a chemotherapeutic drug while increasing the experimental throughput by generating different drug concentrations within the same device. The first microfluidic platform is called SpheroFlow Device (SFD) and aimed to evaluate the cytotoxic effects induced by exposure to a series of mycotoxins of food origin on human Neuroblastoma (NB) cells. Mycotoxins, secondary metabolites found in numerous food products, have been associated with chronic and acute health effects upon human and animal exposure. For our investigation, spheroids were obtained and characterized from a NB cell line (SH-SY5Y). Subsequently, these spheroids were transferred to the microfluidic device specially designed and fabricated in PDMS through the replica molding process. The spheroids were then exposed to various concentrations of mycotoxins for different time intervals using a pump connected to the device. Following the mycotoxin treatment, analyses were conducted on the spheroids to assess their viability. The second microfluidic platform, named MicroGradient Generator (MGG), can create 5 different concentrations of 5-Fluorouracil (5FU), a chemotherapy drug frequently employed in cancer therapy. The platform was employed to test the drug on Colorectal Cancer (CRC) spheroids, formed using the HCT15 cell line. The microfluidic chip for drug testing was fabricated from PDMS via replica molding. The HCT15 spheroids were seeded into the microfluidic device, embedded in GelMA, a biocompatible and printable hydrogel. When connected to a syringe pump, the samples could be exposed to the different drug concentrations generated by the device. Qualitative analyses were performed to evaluate the impact of different drug concentrations on CRC tumor spheroids. The integration of microfluidic technology with 3D tumor models holds promise for advancing drug testing and toxicological studies, offering a more physiologically relevant approach to understanding the effects of various compounds on tumor cells.

I modelli sperimentali standard in vitro hanno dimostrato di essere inestimabili nel progresso della nostra conoscenza dei sistemi biologici per decenni, nonostante siano affetti da diverse limitazioni. Con un focus sulla ricerca sul cancro, sottolineiamo la loro scarsa capacità di mimare la complessità e l'eterogeneità dei tumori umani e il limitato controllo sulla composizione spazio-temporale del microambiente. I progressi tecnologici nella bio- e microfabbricazione stanno rivoluzionando la ricerca sul cancro fornendo strumenti che ricreano più fedelmente l'architettura tridimensionale (3D) e l'ambiente dei tumori nativi rispetto alle tradizionali colture cellulari bidimensionali (2D). L'integrazione di modelli 3D con tecnologie microfluidiche consente un ulteriore controllo della dinamica spazio-temporale dei microambienti tumorali in vivo. Gli obiettivi principali della ricerca proposta sono due: valutare i rischi tossicologici delle micotossine e condurre test di farmaci su modelli di cancro umano. A questo scopo, progetteremo, produrremo e convalideremo due piattaforme microfluidiche. La prima è dedicata all'indagine della citotossicità indotta dalle micotossine, mentre la seconda si concentra sull'analisi della citotossicità indotta da un farmaco chemioterapico, aumentando la capacità sperimentale generando diverse concentrazioni di farmaco nello stesso dispositivo. La prima piattaforma microfluidica si chiama SpheroFlow Device (SFD) e mira a valutare gli effetti citotossici indotti dall'esposizione a una serie di micotossine di origine alimentare su cellule di neuroblastoma umano (NB). Le micotossine, metaboliti secondari presenti in numerosi prodotti alimentari, sono state associate a effetti cronici e acuti sulla salute in seguito a esposizione umana e animale. Per la nostra indagine, sono stati ottenuti e caratterizzati sferoidi da una linea cellulare di NB (SH-SY5Y). Successivamente, questi sferoidi sono stati trasferiti al dispositivo microfluidico appositamente progettato e fabbricato in PDMS mediante il processo di replica molding. Gli sferoidi sono stati poi esposti a varie concentrazioni di micotossine per diversi intervalli di tempo utilizzando una pompa collegata al dispositivo. Dopo il trattamento con micotossine, sono state condotte analisi sugli sferoidi per valutare la loro vitalità. La seconda piattaforma microfluidica, chiamata MicroGradient Generator (MGG), è in grado di creare 5 diverse concentrazioni di 5-fluorouracile (5FU), un farmaco chemioterapico comunemente impiegato nella terapia del cancro. La piattaforma è stata impiegata per testare il farmaco su sferoidi di cancro del colon-retto (CRC), formati utilizzando la linea cellulare HCT15. Il chip microfluidico per i test di farmaci è stato fabbricato in PDMS tramite replica molding. Gli sferoidi di HCT15 sono stati seminati nel dispositivo microfluidico, incorporati in GelMA, un idrogel biocompatibile e stampabile. Collegando il dispositivo a una pompa siringa, i campioni potevano essere esposti alle diverse concentrazioni di farmaco generate dal dispositivo. Sono state eseguite analisi qualitative per valutare l'impatto delle diverse concentrazioni di farmaco sugli sferoidi tumorali di CRC. L'integrazione della tecnologia microfluidica con i modelli tumorali 3D offre promette di far progredire la sperimetazione di farmaci e gli studi tossicologici, offrendo un approccio più fisiologicamente rilevante per comprendere gli effetti di vari composti sulle cellule tumorali.