Confronto tra il microambiente immunitario di metastasi cerebrali da carcinoma mammario ed il loro tumore primitivo.

-Background: Brain metastases represent a frequent complication in metastatic breast cancer and are generally associated with a poor prognosis. Over the last years, the interest for immune microenvironment and its dynamic evolution during the metastatic dissemination process have progressively increased, both for its biological implications in the understanding of mechanisms underlying metastatization and for its potential therapeutic implications. Nevertheless, to date the evolution of the immune microenvironment from primary breast cancer to brain metastases has been poorly characterized. Aim of the study: This study aims to compare the immune microenvironment of breast cancer brain metastases with their paired primary tumor. Materials and methods: Histological specimens and clinical data were retrospectively collected for patients with breast cancer who underwent brain metastasectomy between 2003 and 2019. The immune microenvironment of brain metastases and primary tumors was characterized by multiplex immunofluorescence using two antibodies’ panels (CD4, CD8, Granzyme B, FoxP3, CD68, pan-cytokeratine, DAPI; CD3, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, CD163, pan-cytokeratine, DAPI). For each sample mean immune cell density (cells/mm2) was calculated both in the stroma and the tumor area. Variations in immune cell densities between primary tumors and paired brain metastases were assessed using Wilcoxon signed rank test. Results: Twenty-five patients with available paired primary breast cancer and brain metastases were included. Median age at brain metastases diagnosis was 53 years (range 26-76 years). Breast cancer subtype evaluated on the brain metastases was HER2+ in 52% of cases, triple-negative in 24% and hormone receptor positive/HER2- in the remaining 24%. Compared to the immune microenvironment of primary tumors, both the tumoral and stromal compartments of brain metastases presented with a significantly lower density of total lymphocytes (CD3+, p<0,001), cytotoxic lymphocytes (CD8+, p<0,001) and activated lymphocytes (Granzyme B+, p<0.001). On the contrary, a significant enrichment in regulatory T (T-reg) lymphocytes (CD4+ FoxP3+, p<0,001). Moreover, in brain metastases the lymphocyte infiltrate was characterized by a more anergic phenotype, with higher levels of CD3+/ PD-1+ cells (stroma p<0,001; tumor p=0,003), and CD-3+/PD-1+/LAG3+ cells (stroma p=0,038; tumor p=0,014). Immune check-points PD-L1 and TIM-3 were less expressed in the tumor area (PD-L1 tumor area p<0,001) and in both the stromal and tumor compartments (TIM-3 stroma p=0,011; tumor p=0,007) of the brain metastases, respectively. In addition, the immune microenvironment of brain metastases presented higher densities of macrophages in the tumor area (p=0.008) and of M2-polarized macrophages CD163+ (p<0,001) in the stromal area. Conclusions: Breast cancer brain metastases present a more immunosuppressive microenvironment compared to their primary breast cancer, enriched in immunosuppressive cell populations, as T-reg lymphocytes and M2-polarized tumor associated macrophages. Beyond allowing for a better understanding of immune escape strategies acquired by the tumor during the metastatic dissemination process, these may represent a potential target for novel immunotherapeutic strategies.  

-Razionale: Le metastasi cerebrali rappresentano una frequente complicanza nel carcinoma mammario metastatico e sono generalmente associate ad una prognosi sfavorevole. Negli ultimi anni, l’interesse per il microambiente immunitario e per la sua evoluzione dinamica durante il processo di metastatizzazione è andato progressivamente aumentando, sia per le implicazioni biologiche nella comprensione dei meccanismi alla base della metastatizzazione sia per le potenziali implicazioni terapeutiche. Ad oggi, tuttavia, l’evoluzione del microambiente immunitario dal carcinoma mammario primitivo alla metastasi cerebrale resta ancora scarsamente caratterizzata. Scopo dello studio: Il presente studio mira a confrontare il microambiente immunitario di metastasi cerebrali da carcinoma mammario con quello delle rispettive neoplasie mammarie primitive. Materiali e metodi: Campioni istologici e dati clinici sono stati raccolti retrospettivamente per pazienti con carcinoma mammario che avessero eseguito metastasectomia cerebrale tra il 2003 e il 2019. Il microambiente immunitario delle metastasi cerebrali e della rispettiva neoplasia primitiva è stato caratterizzato mediante immunofluorescenza multiplex con l’impiego di due pannelli anticorpali (CD4, CD8, Granzima B, FoxP3, CD68, pan-citocheratine, DAPI; CD3, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, CD163, pan-citocheratine, DAPI). Per ciascun campione è stata calcolata la densità media delle diverse sottopopolazioni di cellule immunitarie (cellule/mm2) sia nel comparto stromale che nel comparto tumorale. Le variazioni nelle densità delle cellule immunitarie tra i tumori primari e le rispettive metastasi cerebrali sono state valutate utilizzando il test dei ranghi con segno di Wilcoxon per campioni appaiati. Risultati: Sono stati inclusi venticinque pazienti con disponibilità sia del campione di carcinoma mammario primario che della rispettiva metastasi cerebrale. L’età mediana alla diagnosi di metastasi cerebrali è stata pari a 53 anni (range 26-76 anni). Le metastasi cerebrali presentavano un sottotipo HER2+ nel 52% dei casi, triplo-negativo nel 24% e recettori ormonali positivi/HER2-negativo nel restante 24%. Rispetto alla rispettiva neoplasia primitiva, il microambiente immunitario delle metastasi cerebrali si caratterizzava per minor densità di linfociti totali (CD3+, p<0,001), linfociti citotossici (CD8+, p<0,001) e di linfociti attivati (granzima B+, p< 0,001), sia nell’area tumorale che nell’area stromale. Le metastasi cerebrali presentavano invece un arricchimento per linfociti T regolatori (CD4+FoxP3+, p<0,001). L’infiltrato linfocitario delle metastasi si è inoltre distinto per un fenotipo più anergico, con maggiori densità di cellule CD3+/PD-1+ (stroma p<0,001; tumore p=0,003) e di CD-3+/PD-1+/LAG3+ (stroma p=0,038; tumore p=0,014). I check-point PD-L1 e TIM-3 sono risultati meno espressi nelle metastasi cerebrali, rispettivamente nell’area tumorale (PD-L1 tumore p<0,001) e in ambedue i comparti (TIM-3 stroma p=0,011; tumore p=0,007). Inoltre, il microambiente immunitario delle metastasi cerebrali presentava densità maggiori di macrofagi nell’area tumorale (p=0,008) e di macrofagi M2-polarizzati CD163+ (p<0,001) nell’area stromale (p<0,001). Conclusioni: Le metastasi cerebrali da carcinoma mammario si caratterizzano per un microambiente immunitario maggiormente immunosoppresso rispetto al microambiente della neoplasia primitiva, con un arricchimento in specifiche sottopopolazioni immunosoppressive, quali linfociti T-reg e macrofagi M2-polarizzati. Oltre a consentire una migliore comprensione delle strategie di evasione immunitaria acquisite dal tumore durante il processo di disseminazione metastatica, queste potrebbero rappresentare un potenziale bersaglio per nuove strategie immunoterapeutiche.