Valutazione tossicologica in vitro ed in vivo di polietilenglicole a diverso peso molecolare

Il polietilenglicole (PEG) è un polimero sintetico che si presenta in diverse forme fisiche a seconda del suo peso molecolare e può avere struttura sia lineare che ramificata. È un materiale inerte, termoplastico, non volatile, caratterizzato da bassa polidispersività e spiccata anfifilicità. È noto per non essere tossico, immunogenico e antigenico, caratteristiche che hanno permesso la sua approvazione da parte della FDA per il suo utilizzo clinico in diversi ambiti di applicazione, quali cosmetico, alimentare e farmaceutico. Alcuni studi hanno però evidenziato l’accumulo del PEG in organi di animali trattati con dosi superiori a quelle usate nei preparati farmaceutici, portando all’ipotesi di un suo possibile accumulo durante terapie a lungo termine, a causa di un’insufficiente eliminazione. Nella prima parte di questo progetto di tesi si è eseguita una valutazione in vivo ed ex vivo della tossicità potenziale di due tipi di PEG lineari a diverso peso molecolare (20-kDa e 40-kDa), somministrati via endovenosa nei ratti alla dose di 100 mg/kg due volte a settimana per dodici settimane, seguiti da un periodo di washout di otto settimane. Lo studio ha indagato l'accumulo e l'eliminazione dei PEG attraverso la tecnica di immunoistochimica e immunofluorescenza a livello dei reni, polmoni, fegato, milza, cervello e cuore. I risultati hanno dimostrato che entrambi i PEG si accumulano in fegato, milza, reni, plesso coroideo e cuore, e per solo il PEG 40-kDa anche nei polmoni, sottolineando come la biodistribuzione possa variare in base al suo peso molecolare. Il periodo di washout ha permesso l’eliminazione dei PEG in tutti gli organi, ad eccezione del PEG 40-kDa nei reni, dove l’eliminazione avviene più lentamente. La principale modifica istologica osservata a seguito della somministrazione dei polimeri è stata la formazione di vacuoli citoplasmatici PEG 40kDa-negativi e PEG 20kDa-positivi nel plesso coroideo alla fine delle 12 settimane di trattamento e in misura significativamente minore al termine del periodo di washout. Nella seconda parte del progetto di tesi, è stata valutata in vitro il meccanismo di uptake dei due polimeri da parte dei macrofagi, utilizzando la linea cellulare THP-1. Per questo, le THP-1 sono state differenziate a macrofagi M0, e sono stati trattati con i PEG coniugati con il colorante fluorescente Cy 5.5 per 24 ore. Infine, è stato valutato l’effetto del trattamento con i PEG sulla polarizzazione dei macrofagi M0 verso il fenotipo M1 e M2. A differenza degli esperimenti in vivo, le indagini in vitro hanno rivelato solo la presenza di vacuoli citoplasmatici PEG-positivi per entrambi i polimeri. Questa differenza potrebbe derivare dal diverso setup degli esperimenti in vivo e in vitro e dalla breve durata degli esperimenti in vitro che non permettono alle cellule di attuare meccanismi adattativi, come la vacuolizzazione. La marcatura con la sonda LysoTracker permette di affermare che i PEG colocalizzano con i lisosomi, probabilmente deputati all’eliminazione dei PEG immagazzinati; tuttavia, ulteriori indagini sono necessarie per approfondire il meccanismo della vacuolizzazione osservata in vivo. Infine, il PEG 20kDa provoca uno shift del fenotipo macrofagico verso quello pro-infiammatorio M1, a differenza del polimero 40KDa, probabilmente a causa della sua maggiore entrata nei macrofagi M0.