Valutazione dell'effetto di Doxorubicina liposomiale direzionata con il Fab di Atezolizumab in modelli in vitro di epatocarcinoma metastatico

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è il tumore primario del fegato più diffuso, e rappresenta una delle principali cause di morte correlata al cancro in tutto il mondo. Tra i principali fattori di rischio associati all’insorgenza di HCC troviamo infezioni virali (HBV, HCV), steatosi epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD), la sua complicanza steatoepatite (MASH) e abuso di alcol. La prognosi correlata a questa patologia è perlopiù infausta: la tardiva comparsa dei sintomi comporta il raggiungimento di una diagnosi di HCC quando il paziente si trova ormai in uno stadio avanzato della malattia. Uno dei principali fattori in grado di promuovere l’aggressività tumorale è il fenomeno della transizione epitelio-mesenchimale (EMT). Questo processo è sfruttato dalle cellule cancerose al fine di acquisire capacità migratorie e di invasione, con la possibilità di dare origine a metastasi, e può essere innescato dal rilascio nel microambiente tumorale (TME) di citochine proinfiammatorie come il TNFα. Tra i più importanti indicatori di EMT vi sono la downregolazione della E-caderina e l’aumento dell’espressione di vimentina, β-catenina e N-caderina. Un altro importante aspetto legato all’aggressività tumorale è rappresentato dall’evasione immunitaria delle cellule cancerose. Queste sono infatti in grado di modulare la risposta immunitaria tramite l’espressione di specifici checkpoint immunitari, tra cui PD-L1. L’interazione tra PD-L1 e il suo recettore PD-1, espresso dai linfociti T attivati, comporta l’inibizione di questi ultimi. Il TME gioca un ruolo fondamentale in questo processo, in quanto l’infiltrato linfocitario è responsabile del rilascio di citochine quali l’IFN-γ in grado di stimolare l’espressione di PD-L1 sulle cellule di HCC. In questo progetto di tesi sono state testate due formulazioni liposomiali contenenti Doxorubicina, denominate SIL (Stealth ImmunoLiposomes) ed SL (Stealth Liposomes), tra cui rispettivamente la prima funzionalizzata con il Fab dell’anticorpo monoclonale Atezolizumab (diretto contro PD-L1), e la seconda non direzionata. Il primo scopo di questa tesi è stato quello di valutare l’effetto delle due formulazioni SIL ed SL sull’espressione genica e proteica del checkpoint immunitario PD-L1 e di altri mediatori dell’evasione immunitaria, su colture bidimensionali delle linee cellulari umane HepG2 e HUH7, stimolate con IFN-γ. La formulazione SIL ha mostrato una significativa efficacia sulla downregolazione di queste proteine, mentre la formulazione SL sembra non essere in grado di modularne l’espressione, su entrambe le linee cellulari. Il secondo obiettivo di questo progetto di tesi è stato quello di valutare l’effetto delle due formulazioni liposomiali sull’espressione genica e proteica dei principali marcatori di EMT sulle linee cellulari umane HepG2 e Huh7 stimolate con TNFα. Sulla linea cellulare umana HepG2 la formulazione SIL comporta una riduzione dell’espressione delle proteine associate al fenotipo mesenchimale attraverso una modulazione trascrizionale, mentre la formulazione SL non sembra essere in grado di regolarne l’espressione. Sulla linea cellulare Huh7 invece il trattamento con SIL comporta una riduzione dell’espressione delle stesse proteine, ma che non coincide con una ridotta espressione genica. La formulazione SL invece non ha effetti modulatori. In conclusione, è possibile affermare che la formulazione direzionata SIL ha un effetto positivo sia sulla regressione della EMT, con la riattivazione dei geni associati al fenotipo epiteliale, sia sul fenomeno dell’evasione immunitaria tumorale, downregolando l’espressione del checkpoint immunitario PD-L1. La formulazione non targetizzata SL invece sembra non essere in grado di modulare in alcun modo questi due eventi.