SYNTHESIS OF KANAMYCIN-HEMIINDIGO CONJUGATES AND RNA-BINDING STUDIES OF INDIGOID LIGANDS IN HUNTINGTON’S DISEASE.

The human genome consists mainly of short tandem repeats. Due to polymorphism and mutations, such repetitive sequences can elongate becoming aberrant beyond a specific length threshold. These repeat expansions in the human genome can cause more than 40 severe diseases, most of which damage the nervous system and lack treatments. The most common cause of repeat expansion diseases is the CXG trinucleotide sequence expansion (X could be any nucleotide). Among these is Huntington's disease (HD), a well-known CAG (cytosine-adenine-guanine) repeats expansion disorder which leads to progressive brain nerve cells degeneration. HD pathophysiology is based on the expanded CAG repeat in the exon 1 of huntingtin (HTT) mRNA that is located within a coding region and results in the translation of a toxic polyglutamine-containing HTT protein (CAG encodes the amino acid glutamine). The CAG repeats also contribute to the development of HD through another mechanism. The RNA structure is altered because the CAG repeats expansions fold into anomalous hairpins that recruit RNA-binding proteins by introducing new aberrant binding sites, leading to loss of function and aberrant behaviour. In HD, the MID1-protein complex, involved in translation induction, may get bound. In the absence of specific treatments, one potential therapeutical strategy involves selective interactions between CAG repeat expansions and organic compounds, preventing the production of aberrant RNA-MID1 protein complexes. Along these lines, several attempts have been made and the dissertation describes synthesis approaches, isolation and characterization of novel kanamycin-hemiindigo conjugates and RNA-binding properties investigation of aurones, by bioanalytical and biological methods, as potential scaffolds for the design of selective binders for the CAG RNA. In parallel, synthesis of Huntington mRNA samples has been conducted and the prominent compounds were tested in an RNA pull-down assay in vitro for the detection of the decreased binding between MID1 and mutant HTT RNA CAG repeats. Findings shown that one of the selected molecules does inhibit the binding.

Il genoma umano è costituito principalmente da brevi sequenze di DNA ripetute. A causa di polimorfismo e mutazioni, tali sequenze possono allungarsi diventando anomale oltre una specifica soglia di lunghezza. Le sequenze ripetute nel genoma umano possono causare oltre 40 gravi malattie, la maggior parte delle quali danneggiano i neuroni del sistema nervoso e mancano di cure specifiche. La causa più comune di queste malattie è la ripetizione della sequenza trinucleotidica CXG (X può essere qualsiasi nucleotide). Tra queste, la malattia di Huntington è un disturbo che porta alla progressiva degenerazione delle cellule nervose. La fisiopatologia è basata su una mutazione che causa la ripetizione di triplette CAG (citosina-adenina-guanina) all'interno dell'esone 1 dell'mRNA huntingtin. Tale ripetizione si trova all'interno di una regione (Htt) codificante che perciò traduce in una proteina anomala, chiamata huntingtina (HTT), con una coda di poliglutammina (CAG codifica per l’aminoacido glutammina). Ripetizioni della sequenza CAG contribuiscono allo sviluppo della malattia attraverso un ulteriore meccanismo. Tali triplette ripetute alterano la struttura dell'RNA che si ripiega in hairpin anomali che, introducendo dei nuovi siti di binding, reclutano proteine coinvolte nell'induzione del meccanismo di traduzione, alterandone il funzionamento fisiologico. In assenza di trattamenti specifici, una strategia terapeutica potenziale esplorata prevede il binding selettivo fra sequenze CAG e composti organici, inibendo perciò la formazione anomala dei complessi RNA-proteina MID1. Durante il progetto sono stati fatti diversi tentativi di sintesi, isolamento e caratterizzazione di nuovi coniugati kanamicina-hemindigo e studi di binding all’RNA di auroni attraverso metodi bioanalitici e biologici. In parallelo, è stata condotta la sintesi di mRNA huntingtin e i composti più promettenti sono stati testati attraverso saggi di RNA pull-down per individuare quali inibissero il binding tra proteina MID1 ed mRNA huntingtin. I risultati finali hanno mostrato il successo di un composto nel mascherare il sito di binding.