Produzione eterologa dell'enzima mitocondriale umano HPDL e analisi bioinformatica della mutazione G50D implicata nella patologia NEDSWMA.

The objective of this thesis is to present an experimental procedure that optimizes conditions for producing in Escherichia coli the human mitochondrial enzyme HPDL (4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase-like protein, UniProt ID: Q96IR7). This study is part of a larger project on the physicochemical characterization of the HPDL protein, initiated by the Master’s degree student Gianmarco Paloscia from the University of Padua. HPDL is of great medical interest because, although structure and function are still unknown, several allelic variants, including the homozygous G50D mutation, have been isolated in patients with the rare pediatric neurodegenerative disorder NEDSWMA (Neurodevelopmental Disorder with Progressive Spasticity and Brain White Matter Abnormalities). Laboratory techniques used include PCR for Restriction Free Cloning (RFC), agarose gel electrophoresis for qualitative evaluation of PCR products, SDS PAGE associated with polyacrylamide gel staining and western blot (WB), to estimate the amount of recombinant protein produced. Image acquisition of the gels and antibody-immobilized membrane was performed by automated systems. Finally, the structures of HPDL wild type and with the G50D mutation were predicted using the algorithm AlphaFold Server and visualized with the software ChimeraX.

L'obiettivo di questa tesi è presentare una procedura sperimentale che ottimizzi le condizioni per la produzione in Escherichia coli dell'enzima mitocondriale umano HPDL (4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase-like protein, UniProt ID: Q96IR7). Questo studio prende parte a un progetto più ampio di caratterizzazione fisico-chimica della proteina HPDL, avviato dal laureando magistrale patavino Gianmarco Paloscia. HPDL è di grande interesse medico poiché, nonostante la struttura e la funzione siano ancora sconosciute, diverse varianti alleliche, inclusa la mutazione omozigote G50D, sono state isolate in pazienti affetti dalla rara patologia neurodegenerativa pediatrica NEDSWMA (Neurodevelopmental Disorder with Progressive Spasticity and Brain White Matter Abnormalities). Le tecniche di laboratorio utilizzate includono: la PCR per il clonaggio senza enzimi di restrizione (Restriction Free Cloning, RFC), l’elettroforesi su gel di agarosio per la valutazione qualitativa dei prodotti di PCR, l’SDS PAGE associata a colorazione di gel di poliacrilamide e western blot (WB) per stimare la quantità di proteine ricombinanti prodotte. L’acquisizione delle immagini dei gel e della membrana immobilizzata con anticorpi è stata eseguita mediante sistemi automatici. Infine, le strutture di HPDL wild type e con la mutazione G50D sono state predette utilizzando l'algoritmo AlphaFold Server e visualizzate con il software ChimeraX.