Sviluppo di biosensori per la misura combinata dei livelli mitocondriali di calcio e pH

L’omeostasi ionica governa la fisiologia del mitocondrio e il metabolismo cellulare. Nella membrana mitocondriale interna sono presenti numerosi trasportatori che mediano l’influsso e l’efflusso di ioni generando movimenti di ioni che regolano i processi fisiologici dell’organello. Ad esempio, il gradiente protonico intramitocondriale è utilizzato dall’ATP sintasi per generare ATP, mentre il Ca2+ intramitocondriale svolge il ruolo di secondo messaggero regolando vari processi fisiologici. A conferma dell’importanza di questi parametri intracellulari, la disregolazione dell’omeostasi ionica è associata a numerose patologie umane. E’ quindi importante avere a disposizione tecnologie per monitorare in modo accurato l’omeostasi ionica mitocondriale. A tal fine, negli ultimi decenni sono stati sviluppati biosensori fluorescenti per la misurazione della concentrazioni di singoli ioni, come ​​[Ca2+] e ​[H+]. Tuttavia, essi non sono mai stati combinati tra loro per la misurazione simultanea di più parametri, in modo da studiarne meglio l’interazione. In questo lavoro di tesi abbiamo combinato due sonde, ciascuna formata da due biosensori fluorescenti. Una è mitoNGGECO1 che misura la [Ca2+], rilevata attraverso l’emissione di fluorescenza verde. L’altra è pHScarlet, che misura il pH attraverso fluorescenza rossa. Questi due biosensori sono stati uniti da diverse tipologie di linker: una sonda è stata progettata con un linker rigido e l’altra con un linker flessibile. In seguito ne abbiamo valutato la performance: la sonda con il linker rigido si è dimostrata la migliore strategia per la rilevazione indipendente dei due parametri. Lo strumento ci permette di misurare simultaneamente i livelli intramitocondriali dei due ioni e di capirne la regolazione reciproca del trasporto nelle membrane per comprendere come il trasporto ionico verrà modificato nel corso delle patologie.