Eliminare l'autofosforilazione di CaMKIIδ mediante editing di basi con CRISPR-Cas9 migliora la sopravvivenza e la funzione cardiaca in topi con insufficienza cardiaca

Background: Cardiovascular diseases are the main cause of worldwide morbidity and mortality, highlighting the need for new therapeutic strategies. Autophosphorylation and subsequent overactivation of the cardiac stress-responsive enzyme CaMKIIδ (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IIδ) serves as a central driver of multiple cardiac disorders. Methods: To develop a comprehensive therapy for heart failure, we used CRISPR-Cas9 adenine base editing to ablate the autophosphorylation site of CaMKIIδ. We generated mice harboring a phospho-resistant CaMKIIδ mutation in the germline and subjected these mice to severe transverse aortic constriction, a model for heart failure. Cardiac function, transcriptional changes, apoptosis, and fibrosis were assessed by echocardiography, RNA sequencing, terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling staining, and standard histology, respectively. Specificity toward CaMKIIδ gene editing was assessed using deep amplicon sequencing. Cellular Ca2+ homeostasis was analyzed using epifluorescence microscopy in Fura-2-loaded cardiomyocytes. Results: Within 2 weeks after severe transverse aortic constriction surgery, 65% of all wild-type mice died, and the surviving mice showed dramatically impaired cardiac function. In contrast to wild-type mice, CaMKIIδ phospho-resistant gene-edited mice showed a mortality rate of only 11% and exhibited substantially improved cardiac function after severe transverse aortic constriction. Moreover, CaMKIIδ phospho-resistant mice were protected from heart failure-related aberrant changes in cardiac gene expression, myocardial apoptosis, and subsequent fibrosis, which were observed in wild-type mice after severe transverse aortic constriction. On the basis of identical mouse and human genome sequences encoding the autophosphorylation site of CaMKIIδ, we deployed the same editing strategy to modify this pathogenic site in human induced pluripotent stem cells. It is notable that we detected a >2000-fold increased specificity for editing of CaMKIIδ compared with other CaMKII isoforms, which is an important safety feature. While wild-type cardiomyocytes showed impaired Ca2+ transients and an increased frequency of arrhythmias after chronic β-adrenergic stress, CaMKIIδ-edited cardiomyocytes were protected from these adverse responses. Conclusions: Ablation of CaMKIIδ autophosphorylation by adenine base editing may offer a potential broad-based therapeutic concept for human cardiac disease.

Contesto: le malattie cardiovascolari rappresentano la principale causa di morbilità e mortalità a livello mondiale, sottolineando la necessità di nuove strategie terapeutiche. L'autofosforilazione e la successiva iperattivazione dell'enzima cardiaco CaMKIIδ (chinasi IIδ dipendente da Ca2+/calmodulina) svolgono un ruolo centrale in molteplici disturbi cardiaci. Metodi: per sviluppare una terapia completa contro l'insufficienza cardiaca, è stato utilizzato l'editing di basi adenine CRISPR-Cas9 per eliminare il sito di autofosforilazione di CaMKIIδ. Sono stati generati topi con una mutazione fosfo-resistente di CaMKIIδ nel genoma e sono stati sottoposti a costrizione aortica trasversale severa, un modello per l'insufficienza cardiaca. La funzione cardiaca, i cambiamenti trascrizionali, l'apoptosi e la fibrosi sono stati valutati tramite ecocardiografia, sequenziamento dell'RNA, colorazione TUNEL e istologia standard. La specificità dell'editing del gene CaMKIIδ è stata valutata usando il sequenziamento profondo degli ampliconi. L'omeostasi cellulare del Ca2+ è stata analizzata usando la microscopia a epifluorescenza in cardiomiociti caricati con Fura-2. Risultati: entro due settimane dall'intervento di costrizione aortica trasversale severa, il 65% di tutti i topi wild-type è morto e i topi sopravvissuti hanno mostrato una funzione cardiaca significativamente compromessa. A differenza dei topi wild-type, i topi editati con il gene CaMKIIδ fosforesistente hanno mostrato un tasso di mortalità di solo l'11% e hanno mostrato una funzione cardiaca sostanzialmente migliore dopo la costrizione aortica trasversale. Inoltre, i topi con mutazione fosfo-resistente di CaMKIIδ sono stati protetti dai cambiamenti aberranti nell'espressione genica cardiaca, dall'apoptosi miocardica e dalla successiva fibrosi osservate nei topi selvatici dopo la costrizione aortica trasversale severa. Basandosi sulle sequenze genomiche, identiche nel topo e nell'uomo, che codificano per il sito di autofosforilazione di CaMKIIδ, è stata utilizzata la stessa strategia di editing per modificare questo sito patogenetico nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane. È stata rilevata una significativa specificità di editing oltre 2000 volte maggiore per CaMKIIδ rispetto ad altre isoforme di CaMKII, il che rappresenta un'importante caratteristica di sicurezza. Mentre i cardiomiociti wild-type hanno mostrato un'alterazione transiente di Ca2+ e un aumento della frequenza di aritmie dopo lo stress cronico β-adrenergico, i cardiomiociti con CaMKIIδ editato sono risultati essere protetti da queste risposte avverse. Conclusioni: l'eliminazione dell'autofosforilazione di CaMKIIδ tramite editing di basi potrebbe offrire un potenziale approccio terapeutico per le malattie cardiache umane.