Approcci molecolari per lo studio della relazione tra CRYPTOCHROME e CALMODULINA in lievito e in Drosophila melanogaster

La flavoproteina fotosensibile CRYPTOCHROME (CRY), che nel moscerino della frutta Drosophila melanogaster è espressa a livello di retina e neuroni laterali e dorsali, è di primaria importanza nella regolazione dei ritmi circadiani. In ricerche precedenti è stato osservato che uno dei meccanismi regolatori di CRY è basato sulla sua interazione con la CALMODULINA (CaM); tale legame influenza la stabilità di CRY ed è mediato da stimoli luminosi e da oscillazioni nelle concentrazioni di Ca2+. Allo scopo di individuare i domini di interazione tra CRY e CaM responsabili della regolazione mediata dal Ca2+, in questo studio abbiamo ottimizzato un protocollo di mutagenesi casuale tramite error-prone PCR (EP-PCR) a partire dalla sequenza codificante CRY, con l’obiettivo di modificare il suo dominio di legame con CaM. Le sequenze così mutagenizzate sono state poi trasformate in lievito e, tramite yeast-2-hybrid (Y2H) assay, si è cercato di identificare eventuali mutanti di CRY che non fossero più in grado di interagire con la Calmodulina, individuando così la localizzazione del loro dominio di interazione. Parallelamente, è stata generata una linea di Drosophila per indagare le variazioni dei livelli di Ca2+ nella retina. A partire da tali basi sarà dunque possibile approfondire la relazione tra CRY, CaM e Ca2+ in Drosophila.