Endogenous Tagging of the exercise-related gene ''ExeRIKEN'' with Red Fluorescent Protein (RFP).

Physical activity is the only effective treatment efficiently counteracting Insulin Resistance (IR). However, our understanding of the molecular pathways orchestrating the beneficial responses to exercise is still fragmented. Thus, it is crucial to identify new players involved in muscle metabolic adaptations to exercise in order to develop new strategies addressing alterations in muscular glucose handling. Moreover, since 90% of scientific publication all focus on 2000 genes, it is imperative to shift our attention into the “neglected” genome to identify new potential therapeutic targets. Recently, our laboratory identified TFEB as a critical transcription factor regulating skeletal muscle metabolism during exercise. Activated by Ca2+ waves and the calcineurin pathway, TFEB independently coordinates glucose uptake, mitochondrial biogenesis, fatty acid oxidation, and ATP production. To enhance our comprehension of the TFEB and exercise-dependent gene network, we cross-referenced TFEB-overexpressing muscles transcriptomic data with gene expression profiles from mice trained for four weeks. With the aim to identify novel factors contributing to metabolic adaptation to exercise within the "neglected genome," we examined cDNA sequences with unknown function and carrying an Open Reading Frame (ORF). This led to the identification of a commonly upregulated uncharacterized gene, here named ExeRiken. Preliminary data suggest that ExeRiken is a molecular player involved in the regulation of skeletal muscle glucose homeostasis. Indeed, ExeRiken knock-down in an exercise-mimicking genetic model showed a reduced muscular glycogen content; moreover, total body knockout animals preferentially rely on lipid metabolism during daytime. Since ExeRIKEN gene has only recently been validated as protein coding, there are not many tools available for the study and characterization of this protein in various biological systems. Therefore, during my master's degree internship, I contributed to the creation of an HEK293T cell line with the ExeRIKEN gene endogenously tagged with Red Fluorescent Protein. This new cellular model will enable us to investigate the cellular localization of the protein and identify potential molecular interactors.

L'attività fisica è l'unico trattamento che contrasta efficacemente la resistenza all'insulina (IR). Tuttavia, la nostra comprensione delle vie molecolari che orchestrano le risposte positive all'esercizio fisico è ancora frammentaria. Pertanto, è cruciale identificare nuovi protagonisti coinvolti negli adattamenti metabolici muscolari all'esercizio fisico per poter sviluppare nuove strategie che affrontino le alterazioni nella gestione del glucosio muscolare. Inoltre, poiché il 90% delle pubblicazioni scientifiche si concentra su 2000 geni, è imperativo spostare la nostra attenzione verso il genoma "trascurato" per identificare nuovi potenziali bersagli terapeutici. Recentemente, il nostro laboratorio ha identificato TFEB come un fattore di trascrizione critico nella regolazione del metabolismo muscolare scheletrico durante l'esercizio fisico. Attivato dalle onde di Ca2+ e dalla via della calcineurina, TFEB coordina indipendentemente l'assorbimento del glucosio, la biogenesi mitocondriale, l'ossidazione degli acidi grassi e la produzione di ATP. Per migliorare la nostra comprensione della rete genica dipendente da TFEB e dall'esercizio fisico, abbiamo incrociato i dati trascrittomici di muscoli che sovraesprimono TFEB con i profili di espressione genica di topi allenati per un periodo di quattro settimane. Con l'obiettivo di identificare nuovi fattori che contribuiscono nell'adattamento metabolico all'esercizio, all'interno del "genoma trascurato", abbiamo esaminato sequenze di cDNA con funzione sconosciuta e contenenti un Open Reading Frame (ORF). Questo ha portato all'identificazione di un gene non caratterizzato comunemente sovraregolato, qui denominato ExeRiken. I dati preliminari suggeriscono che ExeRiken è un protagonista molecolare coinvolto nella regolazione dell'omeostasi del glucosio nel muscolo scheletrico. Infatti, il modello genetico knock-down di ExeRiken che imita l'esercizio ha mostrato un contenuto ridotto di glicogeno muscolare; inoltre, gli animali knockout totali del gene preferiscono fare affidamento sul metabolismo dei lipidi durante il giorno. Poiché il gene ExeRiken è stato solo recentemente validato come codificante per una proteina, non ci sono molti strumenti disponibili per lo studio e la caratterizzazione di questa ultima nei vari sistemi biologici. Pertanto, durante il mio tirocinio per la laurea magistrale, ho contribuito alla creazione di una linea cellulare HEK293T con il gene ExeRiken etichettato endogenamente con la Proteina Fluorescente Rossa. Questo nuovo modello cellulare ci permetterà di indagare la localizzazione cellulare della proteina e identificare potenziali interattori molecolari.