Production, Purification & in-vitro Inhibition of SARS-CoV-2 WT-Main Protease by Newly Synthesized Ebselen Derivatives

The SARS-CoV-2 pandemic, starting in 2019, required intensive efforts to find efficient therapeutic interventions against the viral infection. While mRNA vaccines were quickly developed and approved in 2020, the necessity for alternative therapeutic strategies remains essential. Using computational models, attention was soon gathered to a possible Achilles heel of the virus, the Main protease (MPro). MPro is a key protease that processes the translated viral polyproteins into the cleaved single proteins that are part of the virion’s assembly structure. High throughput screening identified compounds potentially inhibiting the SARS-CoV-2 Main protease, indicating a feasible approach to target a conserved protein pocket, thus minimizing the given challenges of the mutation-prone virus. In this thesis, we explore the inhibition of the SARS-CoV-2 main protease through in vitro screening of novel organoselenium compounds based on the structure of Ebselen. Eleven derivatives were evaluated for their inhibitory potential using Ebselen as a control. This study contains the production of highly purified SARS-CoV-2 main protease using bacterial expression, UV-visible spectroscopy for the molecular characterization, and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based inhibition assays. Furthermore, the compounds’ binding specificity was determined through mass spectrometry analysis. Our findings demonstrate that these Ebselen derivatives show significant inhibitory activity toward the target, implementing their potential as therapeutic agents and creating new questions about the compound's binding characteristics. This work contributes to the ongoing development of antiviral therapies against SARS-CoV-2 infections and shows the therapeutic efficiency of organoselenium-based molecules.

La pandemia di SARS-CoV-2, iniziata nel 2019, ha richiesto sforzi intensi per trovare interventi terapeutici efficaci contro l'infezione virale. Mentre i vaccini a base di mRNA sono stati rapidamente sviluppati e approvati nel 2020, la necessità di strategie terapeutiche alternative rimane essenziale. Utilizzando modelli computazionali, l'attenzione è stata presto rivolta a un possibile tallone d'Achille del virus, la proteasi principale (MPro). La MPro è una proteasi chiave che elabora le poliproteine virali tradotte nelle singole proteine scisse che fanno parte della struttura di assemblaggio del virione. Lo screening high throughput ha identificato composti potenzialmente in grado di inibire la proteasi principale del SARS-CoV-2, indicando un approccio fattibile per colpire una tasca proteica conservata, minimizzando così le sfide attese da un virus soggetto a mutazioni. In questa tesi, seguendo questo tipo di approccio sperimentale, esploriamo l'inibizione della proteasi principale della SARS-CoV-2 attraverso lo screening in vitro di nuovi composti organoselenici basati sulla struttura dell'Ebselen. Undici derivati sono stati valutati per il loro potenziale inibitorio utilizzando Ebselen come controllo. Questo studio comprende la produzione della proteasi principale della SARS-CoV-2 altamente purificata mediante espressione batterica, la spettroscopia UV-visibile per la caratterizzazione molecolare e i saggi di inibizione basati sul trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET). Inoltre, la specificità del legame del composto è stata determinata attraverso l'analisi della spettrometria di massa. I nostri risultati dimostrano che questi derivati di Ebselen mostrano una significativa attività inibitoria, implementando il loro potenziale come agenti terapeutici, aprendo alla possibilità di ulteriore caratterizzazione delle diverse caratteristiche di legame del composto. Questo lavoro contribuisce allo sviluppo in corso di terapie antivirali contro le infezioni da SARS-CoV-2 e dimostra l'efficacia terapeutica delle molecole a base di organoselenio.