Background Ovarian cancer (OC) is regarded as a heterogeneous and malignant tumor type differentiated into various subtypes of which the high-grade serous ovarian cancer (HGSOC) is the most frequent and lethal. OC presents high mortality rates because of its nonspecific symptoms shown in the initial stages, absence of screening programs, and lack of knowledge regarding OC physiopathology. Treatment includes surgery and chemotherapy, but chemoresistance, especially in recurrent cases, poses a significant challenge. Currently, the most advanced in-vitro models are patient derived organoids (PDOs), three-dimensional constructs capable of mimicking tumor diversity. PDOs enable the analysis of patient-specific tumor properties and can therefore be employed to personalize therapeutic strategies. PDOs development requires a correct representation of the tumor microenvironment (TME) and the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs), are major regulators within the ECM, and significantly impact tumor proliferation, metastasis, and resistance to therapies by remodeling the ECM and influencing tumor-stromal interactions. Purposes of the study This study aims to successfully derive, culture, and characterize CAFs to enhance our understanding of the ECM and investigate the interactions between CAFs and tumor cells focusing on their impact on cell characteristics and proliferation.  Materials and Methods CAFs were isolated and cultured from HGSOC samples, and their identity was confirmed using both bright-field microscopy and immunofluorescence (IF). Key markers such as CD29, FAP, and α-SMA were used to characterize the CAFs from the primary tumor and omental tissues. To evaluate their proliferation rate, Ki-67 staining was applied. Additionally, co-culture experiments with CAFs and the OVCAR3 cell line were carried out to investigate the interactions and proliferation of both cell types. Results CAFs were successfully derived and characterized from both primary tumor and omental samples, with positive expression of CD29, FAP, and α-SMA confirmed through IF analysis. Combined with the bright-field analysis, morphological differences were observed between the two populations, with omental CAFs exhibiting a rounded shape compared to the spindle-shaped primary tumor CAFs. Ki-67 proliferation analysis revealed 70% Ki-67 positive OVCAR3 cells, while CAFs showed a lower index of 5%, which slightly increased to 6.5% in the co-culture. Conclusions The derivation and culture of CAFs from HGSOC samples yielded viable cells, as confirmed by IF analysis, showing expected morphologies and positive expression of key markers. These findings suggest that our protocol, after further validation, could serve as a viable standardized method for CAFs derivation. Co-culture with OVCAR3 cells led to a slightly increased Ki-67 expression compared to CAFs cultured alone, suggesting a pro-proliferative interaction between the tumor cells and CAFs. This reinforces the importance of focusing on CAF-tumor interactions for developing improved models and therapeutic strategies.

Presupposti dello studio Il cancro ovarico (OC) è considerato una tipologia di tumore eterogeneo e maligno, suddiviso in vari sottotipi, tra i quali il carcinoma sieroso di alto grado (HGSOC) è il più frequente e letale. L'OC mostra alti tassi di mortalità a causa dei sintomi aspecifici nelle fasi iniziali, dell'assenza di programmi di screening e della mancanza di conoscenza riguardo alla fisiopatologia dell'OC. Il trattamento include chirurgia e chemioterapia, ma la chemioresistenza, specialmente nei casi ricorrenti, rappresenta una sfida significativa. Attualmente, i modelli in-vitro più avanzati sono gli organoidi derivati da paziente (PDOs), costrutti tridimensionali capaci di imitare la diversità tumorale. Gli PDOs permettono l’analisi delle caratteristiche tumorali specifiche del paziente e possono quindi essere utilizzati per personalizzare le strategie terapeutiche. Lo sviluppo dei PDOs richiede una corretta rappresentazione del microambiente tumorale (TME) e della matrice extracellulare (ECM). I fibroblasti associati al cancro (CAFs) sono importanti regolatori all'interno dell'ECM e influenzano significativamente la proliferazione tumorale, le metastasi e la resistenza alle terapie, rimodellando l'ECM e influenzando le interazioni tra il tumore e lo stroma. Obiettivi dello studio Questo studio mira a derivare, coltivare e caratterizzare con successo i CAFs per migliorare la comprensione dell'ECM e indagare le interazioni tra i CAFs e le cellule tumorali, concentrandosi sul loro impatto sulle caratteristiche cellulari e la proliferazione.   Materiali e metodi I CAFs sono stati isolati e coltivati da campioni di HGSOC, e la loro identità è stata confermata utilizzando sia la microscopia a campo chiaro che l’immunofluorescenza (IF). Marcatori chiave come CD29, FAP e α-SMA sono stati utilizzati per caratterizzare i CAFs derivati dal tumore primario e dai tessuti omentali. Per valutare il loro tasso di proliferazione è stata applicata la colorazione con Ki-67. Inoltre, sono stati condotti esperimenti di co-coltura con CAFs e la linea cellulare OVCAR3 per indagare le interazioni e la proliferazione di entrambi i tipi. Risultati I CAFs sono stati derivati e caratterizzati con successo sia dai campioni del tumore primario che da quelli omentali, con espressione positiva di CD29, FAP e α-SMA confermata tramite analisi IF. Combinato con l'analisi a campo chiaro, sono state osservate differenze morfologiche tra le due popolazioni, con i CAFs omentali che mostravano una forma arrotondata rispetto ai CAFs del tumore primario, che erano a forma di fuso. L'analisi della proliferazione con Ki-67 ha rivelato un indice di proliferazione del 70% nelle cellule OVCAR3, mentre i CAFs hanno mostrato un indice inferiore del 5%, che è leggermente aumentato al 6,5% in co-coltura con le cellule tumorali. Conclusioni La derivazione e la coltura dei CAFs dai campioni di HGSOC hanno prodotto cellule vitali, come confermato tramite analisi IF, mostrando morfologie attese ed espressione positiva dei marcatori chiave. Questi risultati suggeriscono che il nostro protocollo, dopo ulteriori validazioni, potrebbe servire come un metodo standardizzato valido per la derivazione dei CAFs. La co-coltura con le cellule OVCAR3 ha portato a un leggero aumento del Ki-67 rispetto ai CAFs coltivati da soli, suggerendo un’interazione pro-proliferativa tra le cellule tumorali e i CAFs. Questo rafforza l'importanza di focalizzarsi sulle interazioni tra CAFs e tumore per sviluppare modelli e strategie terapeutiche migliorate.

Innovative Approaches in Ovarian Cancer Treatment: The Synergy of Organoids and Extracellular Matrix in Personalized Medicine

KOTLER, SHELLY-MICHAL
2023/2024

Abstract

Background Ovarian cancer (OC) is regarded as a heterogeneous and malignant tumor type differentiated into various subtypes of which the high-grade serous ovarian cancer (HGSOC) is the most frequent and lethal. OC presents high mortality rates because of its nonspecific symptoms shown in the initial stages, absence of screening programs, and lack of knowledge regarding OC physiopathology. Treatment includes surgery and chemotherapy, but chemoresistance, especially in recurrent cases, poses a significant challenge. Currently, the most advanced in-vitro models are patient derived organoids (PDOs), three-dimensional constructs capable of mimicking tumor diversity. PDOs enable the analysis of patient-specific tumor properties and can therefore be employed to personalize therapeutic strategies. PDOs development requires a correct representation of the tumor microenvironment (TME) and the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs), are major regulators within the ECM, and significantly impact tumor proliferation, metastasis, and resistance to therapies by remodeling the ECM and influencing tumor-stromal interactions. Purposes of the study This study aims to successfully derive, culture, and characterize CAFs to enhance our understanding of the ECM and investigate the interactions between CAFs and tumor cells focusing on their impact on cell characteristics and proliferation.  Materials and Methods CAFs were isolated and cultured from HGSOC samples, and their identity was confirmed using both bright-field microscopy and immunofluorescence (IF). Key markers such as CD29, FAP, and α-SMA were used to characterize the CAFs from the primary tumor and omental tissues. To evaluate their proliferation rate, Ki-67 staining was applied. Additionally, co-culture experiments with CAFs and the OVCAR3 cell line were carried out to investigate the interactions and proliferation of both cell types. Results CAFs were successfully derived and characterized from both primary tumor and omental samples, with positive expression of CD29, FAP, and α-SMA confirmed through IF analysis. Combined with the bright-field analysis, morphological differences were observed between the two populations, with omental CAFs exhibiting a rounded shape compared to the spindle-shaped primary tumor CAFs. Ki-67 proliferation analysis revealed 70% Ki-67 positive OVCAR3 cells, while CAFs showed a lower index of 5%, which slightly increased to 6.5% in the co-culture. Conclusions The derivation and culture of CAFs from HGSOC samples yielded viable cells, as confirmed by IF analysis, showing expected morphologies and positive expression of key markers. These findings suggest that our protocol, after further validation, could serve as a viable standardized method for CAFs derivation. Co-culture with OVCAR3 cells led to a slightly increased Ki-67 expression compared to CAFs cultured alone, suggesting a pro-proliferative interaction between the tumor cells and CAFs. This reinforces the importance of focusing on CAF-tumor interactions for developing improved models and therapeutic strategies.
2023
Innovative Approaches in Ovarian Cancer Treatment: The Synergy of Organoids and Extracellular Matrix in Personalized Medicine
Presupposti dello studio Il cancro ovarico (OC) è considerato una tipologia di tumore eterogeneo e maligno, suddiviso in vari sottotipi, tra i quali il carcinoma sieroso di alto grado (HGSOC) è il più frequente e letale. L'OC mostra alti tassi di mortalità a causa dei sintomi aspecifici nelle fasi iniziali, dell'assenza di programmi di screening e della mancanza di conoscenza riguardo alla fisiopatologia dell'OC. Il trattamento include chirurgia e chemioterapia, ma la chemioresistenza, specialmente nei casi ricorrenti, rappresenta una sfida significativa. Attualmente, i modelli in-vitro più avanzati sono gli organoidi derivati da paziente (PDOs), costrutti tridimensionali capaci di imitare la diversità tumorale. Gli PDOs permettono l’analisi delle caratteristiche tumorali specifiche del paziente e possono quindi essere utilizzati per personalizzare le strategie terapeutiche. Lo sviluppo dei PDOs richiede una corretta rappresentazione del microambiente tumorale (TME) e della matrice extracellulare (ECM). I fibroblasti associati al cancro (CAFs) sono importanti regolatori all'interno dell'ECM e influenzano significativamente la proliferazione tumorale, le metastasi e la resistenza alle terapie, rimodellando l'ECM e influenzando le interazioni tra il tumore e lo stroma. Obiettivi dello studio Questo studio mira a derivare, coltivare e caratterizzare con successo i CAFs per migliorare la comprensione dell'ECM e indagare le interazioni tra i CAFs e le cellule tumorali, concentrandosi sul loro impatto sulle caratteristiche cellulari e la proliferazione.   Materiali e metodi I CAFs sono stati isolati e coltivati da campioni di HGSOC, e la loro identità è stata confermata utilizzando sia la microscopia a campo chiaro che l’immunofluorescenza (IF). Marcatori chiave come CD29, FAP e α-SMA sono stati utilizzati per caratterizzare i CAFs derivati dal tumore primario e dai tessuti omentali. Per valutare il loro tasso di proliferazione è stata applicata la colorazione con Ki-67. Inoltre, sono stati condotti esperimenti di co-coltura con CAFs e la linea cellulare OVCAR3 per indagare le interazioni e la proliferazione di entrambi i tipi. Risultati I CAFs sono stati derivati e caratterizzati con successo sia dai campioni del tumore primario che da quelli omentali, con espressione positiva di CD29, FAP e α-SMA confermata tramite analisi IF. Combinato con l'analisi a campo chiaro, sono state osservate differenze morfologiche tra le due popolazioni, con i CAFs omentali che mostravano una forma arrotondata rispetto ai CAFs del tumore primario, che erano a forma di fuso. L'analisi della proliferazione con Ki-67 ha rivelato un indice di proliferazione del 70% nelle cellule OVCAR3, mentre i CAFs hanno mostrato un indice inferiore del 5%, che è leggermente aumentato al 6,5% in co-coltura con le cellule tumorali. Conclusioni La derivazione e la coltura dei CAFs dai campioni di HGSOC hanno prodotto cellule vitali, come confermato tramite analisi IF, mostrando morfologie attese ed espressione positiva dei marcatori chiave. Questi risultati suggeriscono che il nostro protocollo, dopo ulteriori validazioni, potrebbe servire come un metodo standardizzato valido per la derivazione dei CAFs. La co-coltura con le cellule OVCAR3 ha portato a un leggero aumento del Ki-67 rispetto ai CAFs coltivati da soli, suggerendo un’interazione pro-proliferativa tra le cellule tumorali e i CAFs. Questo rafforza l'importanza di focalizzarsi sulle interazioni tra CAFs e tumore per sviluppare modelli e strategie terapeutiche migliorate.
Ovarian cancer
Organoids
Extracellular matrix
Drug screening
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.12608/72103