Valutazione in vivo della biocompatibilità del miocardio porcino decellularizzato in un modello preclinico animale di impianto sottocutaneo nel ratto

Background: Cardiovascular disorders are the leading cause of global mortality and a major contributor to disability. The prevalence in Europe of heart failure, which can be considered the final consequence in almost all cases of cardiovascular diseases, is 1-2%, with the mortality rate of 53-67% generally after five years after diagnosis in all types of affected patients, and it increases significantly in advanced stages of disease. Currently, the gold-standard in the treatment of advanced heart failure is cardiac transplantation, which, however, has the major limitation of the scarcity of available organs. Tissue engineering represents a valuable tool to answer this problem in the future, aiming at regenerating heart muscle from a decellularized porcine heart repopulated with autologous stem cells. The present study is part of a novel decellularization protocol proposed by our research group and based on the use of Tergitol, which is found to be an efficient detergent. For the first time, this protocol was applied to a whole porcine heart. Aim of the study: Evaluation of the effectiveness of the proposed decellularization protocol; in vivo evaluation of the biocompatibility of decellularized porcine myocardium, in order to understand if the proposed decellularization protocol can be applied for the development of scaffolds that can be used in further preclinical studies and, in the future, in the clinic Material and methods: The decellularized porcine heart was studied by DNA extraction and quantification and histological analysis, in order to assess the effectiveness of decellularization and the damage caused to the extracellular matrix. For the biocompatibility study, patches of porcine myocardium taken from both the decellularized and native heart were implanted into the subcutaneous tissue of rats and subsequently explanted at 1, 4 and 8 weeks. The removed tissues were studied by histology (Hematoxylin-Eosin, Masson's Trichrome) and immunofluorescence (nucleus-specific DAPI staining). Results: Analyses performed on the decellularized scaffold showed that, the proposed protocol is effective in terms of decellularization, while managing to keep the extracellular matrix structurally intact. Histological and immunofluorescence analysis conducted on tissue samples removed from rats, after subcutaneous implantation of the decellularized myocardial patches, showed the absence of a long-term inflammatory and immune response, and no structural alterations in host tissues were detected. Conclusions: Decellularized tissue has shown optimal properties in terms of biocompatibility and biodegradability, so it can be considered in further preclinical studies in higher animals, in the implementation of recellularization protocols, as well as in the development of hybrid biomaterials and decellularized scaffolds designed for the regeneration of ischemic myocardium or as models of heart disease.

Presupposti dello studio: I disturbi cardiovascolari rappresentano la principale causa di mortalità globale e uno dei principali fattori che contribuiscono alla disabilità. Lo scompenso cardiaco, che può essere considerato la conseguenza finale di quasi la totalità delle affezioni cardiovascolari, ha una prevalenza in Europa dell’1-2% e una mortalità a 5 anni dalla diagnosi, per tutti i tipi di pazienti affetti, del 53-67%, aumentando significativamente negli stadi avanzati di malattia. Attualmente, il gold-standard nel trattamento dello scompenso cardiaco avanzato è rappresentato dal trapianto cardiaco, il quale ha però l’importante limite della scarsità degli organi disponibili. L’ingegneria tissutale rappresenta un valido strumento per offrire in futuro una risposta a tale problematica, ponendosi come obiettivo la rigenerazione del muscolo cardiaco a partire da un cuore porcino decellularizzato e ripopolato con cellule staminali autologhe. Il presente studio si inserisce nell’ambito di un innovativo protocollo di decellularizzazione proposto dal nostro gruppo di ricerca e basato sull’utilizzo del Tergitolo, il quale è risultato essere un ottimo detergente. Per la prima volta, tale protocollo è stato applicato a un cuore porcino intero. Scopo dello studio: Valutazione dell’efficacia del protocollo di decellularizzazione proposto; valutazione in vivo della biocompatibilità del miocardio porcino decellularizzato, al fine di comprendere se il protocollo di decellularizzazione proposto possa essere applicato per lo sviluppo di scaffolds utilizzabili in ulteriori studi preclinici e, in futuro, in clinica. Materiali a metodi: Il cuore porcino decellularizzato è stato studiato attraverso estrazione e quantificazione del DNA e analisi istologica, al fine di valutare l’efficacia della decellularizzazione e il danno arrecato alla matrice extracellulare. Per lo studio di biocompatibilità, patches di miocardio porcino prelevati sia dal cuore decellularizzato che da quello nativo, sono stati impiantati nel tessuto sottocutaneo di ratti e successivamente asportati a 1, 4 e 8 settimane. I tessuti espiantati sono stati poi studiati mediante istologia (Ematossilina-Eosina e Tricromica di Masson) e immunofluorescenza (colorazione DAPI nucleo-specifica). Risultati: Le analisi condotte sullo scaffold decellularizzato hanno mostrato come il protocollo proposto sia efficace in termini di decellularizzazione, riuscendo al tempo stesso a mantenere intatta, dal punto di vista strutturale, la matrice extracellulare. L’analisi istologica e l’immunofluorescenza condotte sui campioni tissutali prelevati dai ratti, previo impianto sottocutaneo dei patches di miocardio decellularizzato, hanno mostrato l’assenza di una risposta infiammatoria e immunitaria a lungo termine e non sono state rilevate alterazioni strutturali nei tessuti dell’ospite. Conclusioni: Il tessuto decellularizzato ha mostrato proprietà ottimali in termini di biocompatibilità e di biodegradabilità, tali per cui può essere considerato in ulteriori studi preclinici su animali di grossa taglia, nell’implementazione di protocolli di ricellularizzazione, oltre che nello sviluppo di biomateriali ibridi e scaffolds decellularizzati pensati per la rigenerazione del miocardio ischemico o per la realizzazione di modelli di malattia cardiaca.