Uno Specifico Profilo del Microbiota associato a colite da immunoterapia e valutato con machine learning: studio di comparazione con pazienti con malattie infiammatorie croniche intestinali e controlli sani.

Introduction. Immuno-mediated colitis is one of the most common gastrointestinal side effects associated with immune checkpoint inhibitors (ICIs). ICIs-colitis shares with inflammatory bowel disease (IBD), including both Crohn’s Disease (CD) and Ulcerative Colitis (UC), the clinical presentation, macroscopic, microscopic, and serological findings, making challenging the differentiation between the two conditions. The gut microbiota has been suggested as an important driver in the pathogenesis of ICIs-colitis as well as in the pathogenesis of IBD. We aimed to assess whether a specific microbiota profile, as measured by a machine learning approach, can be associated with ICIs-colitis and whether it differs from the one assessed in patients with IBD and in healthy controls (HCs). Methods. In this prospective pilot study, consecutive patients with ICIs-colitis, patients with IBD and HCs were enrolled. Stool samples were collected for fecal microbiota assessment analysis by 16S rRNA gene sequencing approach. The raw reads underwent a filtering procedure performed within QIIME2 analysis framework (version 2022.8). Alpha diversity was evaluated on rarefied counts (Rich- ness, Shannon, and Pielou indices; rarefaction level: 31,556), while beta diversity was calculated on normalized counts (Bray-Curtis, Jaccard, Weighted and Unweighted Unifrac; counts normalized with GMPR). The diversity analysis was conducted in R (version 4.1.0). A permutational analysis of variance (PERMANOVA) test on Bray-Curtis dissimilarity was used to test for differences in the microbiota composition between disease status groups (vegan and ecole packages). The MaA-sLin2 package was then used to perform differential abundance analysis at all taxonomic levels. Supervised and unsupervised machine learning algorithms were applied. Results. Nineteen patients with ICIs-colitis, 40 patients with UC (20 active and 20 inactive), 34 with CD (14 active and 20 inactive) and 36 HC were enrolled. Alpha diversity was not significantly different between ICIs-colitis and HCs (p=0.94), while it was statistically significant between IBD and HCs (p=0.02) and between IBD and ICIs-colitis (p=0.03). At phylum levels, we found high levels of Tenericutes in HCs and high levels of Proteobacteria in ICIs-colitis. Moreover, we found high levels of Actinobacteria in IBD compared to the other group. Interestingly, at genus levels, we found very high levels of Enhydrobacters in ICIs-colitis compared to patients with IBD. While at species levels, high levels of Bifidobacterium longum in patients with UC were observed. A specific microbiota profile was found for each group (IBD, ICIs, HC) and was confirmed with sparse partial least squares discriminant analysis, a machine learning-supervised approach. The latter allowed us to observe a perfect class prediction and group separation using the complete information (full Operational Taxonomic Unit table). Conclusion. A machine learning approach to 16S rRNA data identifies a bacterial signature characterizing ICIs-colitis from IBD and HCs. Future researches will clarify whether such microbiota profiling is useful for prediction, early diagnosis and management of patients with ICIs-colitis.

- Introduzione. La colite mediata da inibitori degli immuno-checkpoint è uno degli effetti collaterali gastrointestinali più comuni associati alla terapia. La colite da ICIs condivide con le malattie infiammatorie croniche intestinali (MICI), tra cui la malattia di Crohn (MC) e la colite ulcerosa (CU), la presentazione clinica, i riscontri macroscopici, microscopici e sierologici, rendendo difficile la differenziazione tra le due condizioni. Il microbiota intestinale è stato ipotizzato come un importante fattore nella patogenesi della colite da ICI così come nella patogenesi delle MICI. Il nostro obiettivo è stato quello di valutare se un profilo specifico del microbiota, misurato mediante un approccio di machine learning, possa essere associato alla colite da ICI e se differisca da quello valutato nei pazienti con MICI e nei controlli sani (HCs). Metodi. In questo studio pilota prospettico, sono stati arruolati consecutivamente pazienti con colite da ICI, pazienti con MICI e controlli sani. I campioni fecali sono stati raccolti per l’analisi del microbiota intestinale, eseguita mediante sequenziamento del 16S rRNA. Le row reads sono state sottoposte a una procedura di filtraggio eseguita all’interno del framework di analisi QIIME2 (versione 2022.8). La diversità alfa è stata valutata mediante gli indici di Ricchezza, di Shannon e Pielou), mentre la diversità beta è stata calcolata mediante analisi di Bray-Curtis, Jaccard, Weighted e Unweighted Unifrac). L’analisi della diversità è stata condotta in R (versione 4.1.0). È stato utilizzato un test di analisi della varianza permutazionale (PERMANOVA) sulla dissimilarità Bray-Curtis per testare le differenze nella composizione del microbiota tra i gruppi di stato della malattia. Il pacchetto R MaAsLin2 è stato poi utilizzato per eseguire l’analisi della abbondanza differenziale a tutti i livelli tassonomici. Sono stati applicati algoritmi di machine learning supervisionato e non supervisionato. Risultati. Sono stati arruolati 19 pazienti con colite da ICIs, 40 pazienti con UC (20 con malattia moderata severa e 20 con malattia in remissione), 34 con CD (14 con malattia moderata severa e 20 con malattia in remissione) e 36 controlli sani. La diversità alfa non era significativamente diversa tra colite da ICI e controlli sani (p=0.94), mentre era statisticamente significativa tra MICI e controlli sani (p=0.02) e tra MICI e colite da ICI (p=0.03). A livello di phylum, abbiamo trovato alti livelli di Tenericutes nei controlli sani e alti livelli di Proteobacteria nella colite da ICI. Inoltre, abbiamo trovato alti livelli di Actinobacteria nelle MICI rispetto agli altri gruppi. A livello di genere, abbiamo trovato livelli molto elevati di Enhydrobacter nella colite da ICI rispetto ai pazienti con MICI. A livello di spe-ce, sono stati osservati alti livelli di Bifidobacterium longum nei pazienti con CU. È stato individuato un profilo specifico del microbiota per ciascun gruppo (IBD, ICI, controlli sani) e confermato con l’analisi discriminante a minimi quadrati parziali sparsi, un approccio supervisionato di machine learning. Quest’ultimo ci ha permesso di osservare una previsione perfetta della classe e una separazione dei gruppi utilizzando le informazioni complete (tabella completa delle Unità Tassonomiche Operazionali). Conclusione. L’approccio di machine learning applicato all’analisi 16S rRNA del microbiota identifica un’impronta batterica che caratterizza la colite da ICI rispetto a MICI e controlli sani. Future ricerche chiariranno se tale profilo microbico è utile per la previsione, la diagnosi precoce e la gestione dei pazienti con colite da ICI.